Rezumat al lucrării de cercetare despre științele biologice, autor al articolului științific - Vivek Mahadevan, Jessica C. Pressey, Brooke A. Acton, Pavel Uvarov, Michelle Y. Huang, și colab.

Rezumat KCC2 este K + -Cl− cotransportorul specific neuronului necesar pentru menținerea Cl-intracelular scăzut, care este esențial pentru transmiterea sinaptică inhibitoare rapidă în SNC matur. În ciuda cerinței KCC2 pentru transmiterea sinaptică inhibitoare, înțelegerea mecanismelor celulare care reglează expresia și funcția KCC2 este rudimentară. Am examinat KCC2 în complexul său proteic nativ in vivo pentru a identifica parteneri cheie care interacționează KCC2 care reglează funcția KCC2. Folosind electroforeza albastră pe gel de poliacrilamidă nativă (BN-PAGE), am stabilit că KCC2 nativ există într-un complex macromolecular cu receptori de glutamat de tip kainat (KAR). Am constatat că subunitățile KAR sunt necesare pentru oligomerizarea KCC2 și exprimarea suprafeței. În conformitate cu această constatare, deleția genetică acută și cronică a KAR a scăzut funcția KCC2 și a slăbit inhibarea sinaptică în neuronii hipocampici. Rezultatele noastre dezvăluie KAR-urile ca regulatori ai KCC2, avansând semnificativ înțelegerea noastră crescândă a interacțiunii strânse dintre excitație și inhibare.

kainate

Subiecte similare ale lucrării științifice în Științe biologice, autor al unui articol științific - Vivek Mahadevan, Jessica C. Pressey, Brooke A. Acton, Pavel Uvarov, Michelle Y. Huang, și colab.

Lucrare de cercetare academică pe tema „Receptorii Kainate coexistă într-un complex funcțional cu KCC2 și reglează homeostazia clorurii în neuronii hipocampici”

Receptorii de kainat coexistă într-un complex funcțional cu KCC2 și reglează homeostazia clorurii în neuronii hipocampici

Vivek Mahadevan, 1 Jessica C. Pressey, 1 Brooke A. Acton, 1 Pavel Uvarov, 5 Michelle Y. Huang, 1 Jonah Chevrier, 1 Andrew Puchalski, 1 Caiwei M. Li, 1 Evgueni A. Ivakine, 2 Matti S. Airaksinen, 5 Eric Delpire, 3 Roderick R. McInnes, 2 4 și Melanie A. Woodin1, *

1 Departamentul de biologie celulară și de sisteme, Universitatea din Toronto, Toronto, ON M5S 3G5, Canada 2 Institutul de cercetare pentru copii bolnavi, Toronto, ON M5G 1X8, Canada 3 Departamentul de anestezie, Școala de medicină a Universității Vanderbilt, Nashville, TN 37232, SUA 4Lady Institutul Davis, Spitalul General Evreiesc, Universitatea McGill, Montreal, QC H3T 1E2, Canada 5 Institutul de Biomedicină, Anatomie, Universitatea din Helsinki, 00014 Helsinki, Finlanda „Corespondență: [email protected] http://dx.doi.org /10.1016/j.celrep.2014.05.022

Acesta este un articol cu ​​acces liber sub licența CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/).

KCC2 este cotransportorul K + -CP specific neuronului necesar pentru menținerea CP intracelular scăzut, care este esențial pentru transmiterea sinaptică a inhibitorului rapid în SNC matur. În ciuda cerinței KCC2 pentru transmiterea sinaptică inhibitoare, înțelegerea mecanismelor celulare care reglează expresia și funcția KCC2 este rudimentară. Am examinat KCC2 în complexul său proteic nativ in vivo pentru a identifica parteneri cheie care interacționează KCC2 care reglează funcția KCC2. Folosind electroforeza albastră pe gel de poliacril-amidă nativă (BN-PAGE), am stabilit că KCC2 nativ există într-un complex macromolecular cu receptori de glutamat de tip kainat (KAR). Am constatat că subunitățile KAR sunt necesare pentru oligomerizarea KCC2 și exprimarea suprafeței. În conformitate cu această constatare, deleția genetică acută și cronică a KAR a scăzut funcția KCC2 și a slăbit inhibarea sinaptică în neuronii hipocampici. Rezultatele noastre dezvăluie KAR-urile ca regulatori ai KCC2, avansând semnificativ înțelegerea noastră crescândă a interacțiunii strânse dintre excitație și inhibare.

Transmiterea sinaptică GABAergică hiperpolarizantă în SNC matur depinde de o concentrație scăzută de CP intracelular [CP] KCC2 este membrul specific neuronului din familia genelor K + -CP cotransportor care extrudă în principal CP din neuroni, făcându-l esențial pentru transmisia sinaptică inhibitoare ( Acton și colab., 2012; Blaesse și colab., 2009; Rivera și colab., 1999). Nivelurile fiziologice ale activității neuronale pot regla KCC2 într-un mod Ca2 + -dent-dent pentru a induce plasticitatea sinaptică inhibitoare, care joacă un rol cheie în echilibrul delicat dintre inhibare și excitație (Fiumelli și Woodin, 2007; Lamsa și colab., 2010; Woodin

și colab., 2003). Cu toate acestea, reglarea aberantă a KCC2 are ca rezultat creșterea CP neuronală și contribuie la fiziopatologia numeroaselor tulburări neurologice, inclusiv epilepsie, autism și durere neuropatică (Coull și colab., 2005; Kahle și colab., 2008; Tyzio și colab., 2014; Woo și colab., 2002).

Expresia și funcția membranei KCC2 sunt reglementate de mai multe mecanisme posttranslaționale, inclusiv modificări ale stării de fosforilare, oligomerizare, asociere cu plute lipidice și decolteu prin proteaze (Blaesse și colab., 2006; Lee și colab., 2011; Puskarjov și colab., 2012; Rinehart și colab., 2009; Wata-nabe și colab., 2009). Recent, am făcut o adăugare importantă la această listă de mecanisme care reglează funcția KCC2 prin identificarea unei proteine ​​care interacționează cu KCC2 numită Neto2 (Ivakine și colab., 2013). Am constatat că Neto2 este necesar pentru a menține abundența KCC2 în neuroni și pentru un transport eficient al mediului KCC2. Astfel, interacțiunea KCC2-Neto2 este vitală pentru inhibarea sinaptică normală la neuronii maturi.

Neto2 este un domeniu CUB care conține proteine ​​transmembranare care acționează și ca subunitate auxiliară a receptorilor nativi de glutamat de tip kainat (KAR). Net2 reglează atât cinetica, cât și localizarea sinaptică a subunităților KAR (Copits și colab., 2011; Tang și colab., 2012; Wyeth și colab., 2014; Zhang și colab., 2009). KAR-urile sunt receptori unici de glutamat ionotrop care îndeplinesc funcții multiple în timpul transmisiei sinaptice și al plasticității (Lerma și Marques, 2013). Reglează eliberarea GABAergic de la terminalele presinaptice (Rodriguez-Moreno și colab., 1997), mediază curenții excitatori lent postsinaptic (Castillo și colab., 1997) și sunt implicați în potențarea pe termen lung a neuronului fibros-piramidal cu mușchi în zona CA3 ( Contractor și colab., 2001).

Identificarea interacțiunii Neto2-KCC2, împreună cu demonstrațiile anterioare că Neto2 este o subunitate auxiliară a KAR-urilor, ne-a determinat să ne întrebăm dacă KCC2 și KAR coexistă într-un complex macro-molecular. În special, am examinat rolul subunităților GluK2 care s-au arătat anterior că interacționează cu Neto2 (Copits și colab., 2011; Tang și colab., 2011; Zhang și colab., 2009). În acest studiu, am făcut o descoperire surprinzătoare că KCC2 oligomeric nativ coexistă într-un ansamblu cu subunitatea GluK2 KAR din SNC. Mai mult, am stabilit că KAR-urile sunt necesare pentru a menține atât oligomerizarea KCC2, cât și

expresia acestui transportor în membrană. Când am efectuat o caracterizare electrofiziologică a funcției KCC2 după întreruperea subunității KAR, am constatat că neuronii au un potențial de inversare depolarizat pentru GABA (EGABA). Prin urmare, descoperirile noastre reprezintă o reglare a funcției KCC2 și o inhibare sinap-tică rapidă de către componentele transmisiei excitative.

KAR-urile KCC2 și GluK2 interacționează in vivo și in vitro

Am descoperit recent că KCC2 se leagă de proteina domeniului CUB cu o singură trecere Neto2 și că această interacțiune este necesară pentru extrudarea eficientă a CP în neuronii hipocampici (Ivakine și colab., 2013). Mai multe grupuri au stabilit anterior că Neto2 este o subunitate auxiliară critică a KAR-urilor native, inclusiv GluK2 (Copits și colab., 2011; Tang și colab., 2011; Wyeth și colab., 2014; Zhang și colab., 2009). Acest lucru ne-a determinat să facem ipoteza că KAR-urile

Figura 1. KCC2 interacționează cu KAR GluK2 în creierul șoarecelui și în celulele heteroloage

(A) Complexe native KCC2 din fracții de membrană cerebrală întreagă solubilizate C12E9 imunoprecipitate cu anti-KCC2 și imunoblotate cu anticorpii indicați în dreapta (KCC2, GluK2/3, Neto2). Exemplu reprezentativ al a trei replici independente. IP, imunoprecipitat; I, fracție de intrare (1% din IP); U. fracțiune nelegată (1% din IP); O. oligomer; M. monomer; a se vedea, de asemenea, Figura S1A.

(B) (B |) Experimente de coimmunoprecipitare efectuate în celule HEK293transfectate cu subunități KCC2 și KAR, solubilizate în tampon RIPA, imuno-noprecipitate cu anti-KCC2 și imuno-șterse cu anticorpii indicați în dreapta (KCC2, GluK2/3, myc); vezi și Figurile S1B și S1C. Exemplu reprezentativ de trei până la patru replici biologice independente (Bii) Cuantificarea fracțiilor legate la KCC2 a fost realizată prin măsurarea intensității benzii fracției imunopre-cipitate comparativ cu intrarea totală (10%) utilizând software-ul ImageJ.

(C) Imagini confocale ale neuronilor hipocampici de șoarece DIV 12-14 imunocurați pentru KCC2 endogen (stânga, verde) și GluK1/2 (mijloc, roșu), demonstrând că cele două proteine ​​sunt co-localizate (dreapta, galben). Reprezentant al imaginilor confocale obținute de la 26 de neuroni în patru experimente independente efectuate folosind opt acoperiri. (Barele de scară, 10 mm.) Inserarea inferioară este o mărire de la dendrita primară indicată în casetă.

Toate cifrele rezumative reprezintă media ± SEM. * p