Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Achiziționarea de fonduri, Investigație, Scriere - schiță originală, Scriere - revizuire și editare

asociate

Divizia de Științe a Cancerului, Facultatea de Biologie, Medicină și Sănătate, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit, Divizia de Evoluție și Medicină Genomică, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Investigații, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru patologie, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Scriere - revizuire și editare

Afiliere Manchester Center for Genomic Medicine, North-West Genomics Laboratory Hub, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Marea Britanie

Roluri Analiză formală, Scriere - schiță originală, Scriere - recenzie și editare

Afiliere Health Economics Group, Universitatea din Exeter Medical School, Universitatea din Exeter, Exeter, Devon, Regatul Unit

Roluri Administrare proiect, Resurse, Scriere - recenzie și editare

Departamentul de afiliere pentru patologie, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Scriere - revizuire și editare

Afiliere Manchester Center for Genomic Medicine, North-West Genomics Laboratory Hub, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Marea Britanie

Roluri Arhivarea datelor, Scriere - revizuire și editare

Afiliere Manchester Center for Genomic Medicine, North-West Genomics Laboratory Hub, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Marea Britanie

Roluri Arhivarea datelor, Scriere - revizuire și editare

Afiliere Manchester Center for Genomic Medicine, North-West Genomics Laboratory Hub, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Marea Britanie

Roluri Administrare proiect, Scriere - recenzie și editare

Divizia de afiliere a științelor cancerului, Facultatea de Biologie, Medicină și Sănătate, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Scriere - revizuire și editare

Divizia de afiliere a științelor cancerului, Facultatea de Biologie, Medicină și Sănătate, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Scriere - revizuire și editare

Divizia de afiliere a științelor cancerului, Facultatea de Biologie, Medicină și Sănătate, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Scriere - revizuire și editare

Divizia de afiliere a științelor cancerului, Facultatea de Biologie, Medicină și Sănătate, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Scriere - revizuire și editare

Divizia de afiliere a științelor cancerului, Facultatea de Biologie, Medicină și Sănătate, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Scriere - revizuire și editare

Grup de cercetare privind sindromele tumorale moștenite de afiliere, Institutul de cancer și genetică, Universitatea Cardiff, Cardiff, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru patologie, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Regatul Unit

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru patologie, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Regatul Unit

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: D. Gareth Evans, Emma J. Crosbie

Conceptualizare roluri, curatarea datelor, analiză formală, achiziție de finanțare, supraveghere, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Divizia de Afiliere a Evoluției și Medicinii Genomice, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit, Centrul Manchester pentru Medicină Genomică, Centrul Laboratorului de Genomică Nord-Vest, Universitatea Manchester NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Regatul Unit

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: D. Gareth Evans, Emma J. Crosbie

Conceptualizare roluri, curatarea datelor, analiză formală, achiziție de finanțare, supraveghere, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Divizia de Afilieri a Științelor Cancerului, Facultatea de Biologie, Medicină și Sănătate, Universitatea din Manchester, Spitalul St Mary, Manchester, Regatul Unit, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Spitalul St Mary, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Center, Manchester, Regatul Unit

  • Neil A. J. Ryan,
  • Raymond McMahon,
  • Simon Toby,
  • Tristan Snowsill,
  • Shona Esquibel,
  • Andrew J. Wallace,
  • Sancha Bunstone,
  • Naomi Bowers,
  • Ioana E. Mosneag,
  • Sarah J. Kitson

Cifre

Abstract

fundal

Sindromul Lynch (LS) predispune la cancer endometrial (EC), cancer colorectal și alte tipuri de cancer prin variante patogene moștenite care afectează genele de reparare a nepotrivirii (MMR). Diagnosticarea LS la femeile cu EC poate reduce mortalitatea ulterioară prin cancer prin supravegherea colonoscopică și chimioprevenția aspirinei; permite, de asemenea, testarea în cascadă a rudelor. Un consens în creștere susține screening-ul LS în CE; cu toate acestea, proporția așteptată a testelor pozitive și strategia optimă de testare sunt incerte. Studiile anterioare din sistemele de asistență medicală bazate pe asigurări au fost limitate de criterii restrânse de selecție, neaplicarea testelor standard de referință în mod consecvent și conversia slabă la testarea definitivă. Scopul acestui studiu a fost de a stabili prevalența LS și acuratețea diagnosticului strategiilor de testare a LS într-o populație CE neselectată.

Metode și constatări

Metode

Protocol de studiu

Studiul Proporția tumorilor endometriale asociate cu sindromul Lynch (PETALS) a fost sponsorizat de Universitatea din Manchester, Marea Britanie și aprobat de Comitetul de etică al cercetării din nord-vest (15/NW/0733; Protocolul S1). Studiul a fost înregistrat prospectiv (baza de date privind studiile clinice Cancer Research-UK, ref-13595). Este raportat conform ghidului Consolidarea raportării studiilor observaționale în epidemiologie (STROBE) (Lista de verificare S1), iar setul de date primare este, de asemenea, furnizat (date S1).

Participanți

Femeile au fost recrutate din clinicile de ginecologie de la Universitatea Manchester NHS Foundation Trust (MFT), un mare centru de cancer ginecologic, între octombrie 2015 și ianuarie 2017. Femeile diagnosticate cu EC sau hiperplazie atipică (AH) în ultimii 5 ani au fost eligibile pentru recrutare fără date demografice. sau restricții histologice. AH a fost inclus pentru a capta întregul spectru al neoplaziei endometriale. Toate femeile și-au dat consimțământul scris și informat pentru a participa, oferind ADN din sânge, tumori și date clinice (vârstă, indicele de masă corporală [IMC], etnie auto-raportată), incluzând istorii familiale detaliate (genealogii). Acestea din urmă au fost punctate folosind Bethesda revizuită [19], Amsterdam II [20] și Prediction of MMR Gene Mutations-v.5 scoruri (PREMM5) [21]. Au fost obținute probe suplimentare de la femei cu EC care și-au dat consimțământul ca datele lor clinice, tumorile și ADN-ul să fie utilizate pentru cercetări viitoare între 2013 și 2014 la MFT; genealogiile lor detaliate nu erau disponibile.

Analiza tumorii somatice

Specimenele de histerectomie și biopsie au fost evaluate de 2 patologi ginecologi specialiști în conformitate cu criteriile de stadializare (CE) FIGO-2009 și sistemul de clasificare OMS (AH). Limfocitele de infiltrare a tumorii stromale (TIL) au fost raportate așa cum s-a descris anterior [22]. Profilarea moleculară a tumorii a folosit specimenul de histerectomie atunci când este posibil, dar au fost utilizate specimene de endometru de diagnosticare atunci când nu s-a efectuat histerectomia sau când s-a repetat IHC echivoc. Toate țesuturile au fost fixate în formalină și încorporate parafină în conformitate cu protocoalele clinice locale. Blocurile de țesuturi cu cel mai mare conținut tumoral (> 70%) au fost alese pentru extracția ADN-ului. Tumora a fost fie microdisecată de la 5 × 10 μm secțiuni nectate, fie miez de blocuri de țesut, în funcție de conținutul tumorii. Țesutul adiacent non-malign a fost selectat pentru analiza constituțională comparativă MSI.

IHC pentru cele 4 proteine ​​MMR a fost efectuat folosind modulul automat de colorare Ventana BenchMark ULTRA IHC⁄ in situ (ISH) și sistemul de detectare OptiView, 3 ′ diaminobenzidină versiunea 5 (Ventana Co., SUA) într-un laborator care participă cu succes la asigurarea calității (EQA; UK NEQAS ICC and ISH, Module 7B; https://www.ukneqasiccish.org; S1 Text). Proporția componentei epiteliale tumorale colorate și intensitatea colorării au fost notate de 2 observatori independenți experți care utilizează stroma tumorii ca control intern, așa cum s-a descris anterior [23]. Exemple de pierderi de proteine ​​MMR complete și „neuniforme” sunt ilustrate în textul S1.

Analiza MSI (și MLH1-metilare) a fost efectuată într-un laborator de referință de testare MSI acreditat UKAS ISO15189 care participă cu succes la EQA (https://www.genqa.org). ADN-ul a fost extras și a fost supus conversiei bisulfitului de sodiu folosind kitul Epitect Plus FFPE (Qiagen, Marea Britanie). Sistemul de analiză MSI versiunea 1.2 (Promega, SUA) a fost utilizat cu protocoale clinice standardizate. Grundurile etichetate cu fluorescență au fost utilizate pentru a coamplifica 7 markeri, inclusiv 5 markeri mononucleotidici-repetați (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 și MONO-27) și 2 markeri de control pentanucleotidici de control Penta -C/Penta-D). Statutul MSI a fost determinat de 2 oameni de știință independenți. Profiluri de fragmente identice între tumoare și țesuturi normale potrivite pentru toți cei 5 loci mononucleotidici au fost considerate stabile la microsateliți (MSS); discordanța într-un locus mononucleotidic a fost scăzută la MSI (MSI-L). Discordanța în 2 sau mai multe loci mononucleotidice a fost MSI ridicată (MSI-H). Doar cei cu tumori MSI-H au fost considerați cu risc de LS; acest lucru este în concordanță cu consensul experților [15].

Analiza metilării.

Testarea reflexă a metilării MLH1 a fost efectuată pe tumorile cu deficit de MLH1 și/sau PMS2 și/sau MSI, așa cum s-a descris anterior [24]. ADN-ul purificat a fost amplificat cu primeri specifici bisulfitului în triplicat. O regiune promotor MLH1 conținând 4 dinucleotide CpG a cărei stare de metilare este puternic corelată cu expresia MLH1 a fost analizată folosind pirozecvențierea (PSQ 96MA). Doi oameni de știință independenți au interpretat pirogramele. „Hipermetilarea” a descris> 10% metilare medie în cadrul celor 4 dinucleotide CpG pe peste două treimi din analizele replicate. O proporție a cazurilor de hipermetilare MLH1 a suferit secvențierea MMR standard a liniei germinale pentru a exclude variantele coexistente de cale_MLH1.

Analiza liniei germinale

Indicațiile pentru analiza liniei germinale au fost vârsta de 10%; și caracteristici moleculare tumorale indicative, în special deficitul MMR (MMRd, pierderea epitelială tumorală a proteinei ≥ 1 MMR pe IHC) și/sau MSI-H inexplicabile prin hipermetilare MLH1 somatică.

Testarea metilării s-a făcut numai dacă ≥1 din MLH1 sau PMS2 s-a pierdut în urma imunohistochimiei. „Fără metilare” înseamnă că nu a fost indicat. # PMS2 testat numai dacă PMS2d și nu are path_MLH1, path_MSH2 sau path_MSH6. ^ Una dintre probele MSI-H nu a fost supusă testării liniei germinale, deoarece pacientul a murit înainte de a putea fi prelevat sânge. MSI, instabilitate microsatelit; MSS, stabil microsatelitic; MMR, repararea nepotrivirii; MMRp, MMR competent (fără pierderi de proteine ​​MMR); MMRd, MMR deficient (≥1 proteină MMR pierdută).

Proporția tumorilor asociate cu LS

Am identificat 16 purtători de variante path_MMR, oferind o prevalență globală a LS de 3,2% (IC 95% 1,84% –5,14%). Au existat 8 căi_MSH6, 4 căi_MSH2, 2 căi_MLH1 și 2 căi_PMS2 purtătoare variante (Tabelul 2). Trei cunoscuseră LS, 2 au murit la scurt timp după diagnosticul EC, iar celor 11 resturi li s-au oferit, dintre care 10 au acceptat consiliere genetică. Până în prezent, 14 rude au primit și consiliere genetică. O femeie a purtat 2 VUS_MSH6, considerate patogene în combinație (text S2). Alte 10 femei au avut variante MMR care nu au fost recunoscute de InSiGHT (https://www.insight-group.org), inclusiv 5 variante nedeclarate anterior (text S3). Cea mai mare discrepanță între constatările IHC și MSI a fost observată la cei cu o variantă a liniei germinale_MSH6, cu 5/8 care demonstrează pierderea MSH6 la IHC, dar MSS. O variantă path_MSH6 (MSH6 c.2731C> T p. (Arg911Ter) a fost observată în 3 cazuri index și, prin urmare, ar putea reprezenta o mutație fondator local; cu toate acestea, o revizuire a bazei de date clinice locale indică faptul că această variantă afectează doar 5/487 din LS local familii.

Selectarea femeilor pentru testarea LS a liniei germinale

Vârsta și istoria familiei.

În total, au existat 73 de femei ≤50 de ani, dintre care 7 (10%) aveau LS. Toate cele 7 aveau caracteristici moleculare tumorale indicative (MMRd ± MSI-H). Doar femeile de screening Tabelul 3. Acuratețea testului de diagnostic al criteriilor de selecție clinicopatologice și a strategiilor de triaj bazate pe tumori.

Au fost disponibile date complete de pedigree pentru 300 de femei. Doar 7/300 (2%) și 9/300 (3%) femei cu pedigree detaliate au îndeplinit criteriile Amsterdam II și au revizuit orientările Bethesda, dintre care 4 (57%) și 5 (56%) aveau LS, respectiv. Toate femeile cu LS au avut, de asemenea, caracteristici moleculare tumorale indicative. Scorul mediu general PREMM5 a fost de 3,2% (SD 2,4%). Un total de 164/299 (55%) femei au avut scoruri mai mari decât limita recomandată de 2,5% pentru testarea liniei germinale, cu un scor mediu PREMM5 de 4,3% în acest subgrup și 11 (6,7%) având LS. Un alt 12 femei cu tumori MSS/MSI-L MMR-competente au fost supuse testării liniei germinale din cauza unui cancer anterior asociat LS (n = 3) sau a unui istoric familial indicativ (inclusiv Amsterdam II [n = 2], revizuită Bethesda [n = 4] și PREMM5> 10% [n = 3]). Niciunul nu a purtat o variantă path_MMR sau VUS_MMR.

Deficitul MMR de către IHC.

În total, 132/500 (26%) tumori au fost deficiente în MMR (Tabelul 4), dintre care 83 au fost MSI-H. Femeile cu tumori cu deficit de MMR au fost mai în vârstă decât cele fără pierderi de MMR (diferență medie 3,3 ani, testul t [varianțe inegale] p = 0,007). Dintre cele 24 de femei care au avut tumori cu pierderi neregulate de MMR, una a avut o linie germinativă VUS_MMR, dar niciuna nu a avut LS. Un caz MSS AH a avut o pierdere neplăcută de MSH6 și ulterior s-a constatat că are un VUS_MSH6, dar toate celelalte probe AH au avut MMR intact. Treisprezece tumori nu au reușit prima încercare, dar nu au repetat testarea MMR-IHC.

Analiza MSI.

În total, 89/500 (18%) tumori au fost MSI-H, iar 21/500 (4%) au fost MSI-L. Nici una dintre cele 6 tumori MSI-H MMR-competente nu au fost asociate cu LS (Tabelul 4). Femeile cu tumori MSI-H au fost mai în vârstă decât cele cu tumori MSS (diferență medie de 4,7 ani, p 70 de ani.

Studiul nostru a avut 5 puncte forte. În primul rând, am recrutat 99% dintre femeile eligibile, asigurând o populație imparțială de pacienți consecutivi nerestricționată în funcție de vârstă, subtip histologic sau modalitatea de tratament. Ratele de recrutare de aproximativ 50% au fost raportate anterior, în principal din sistemele de asistență medicală bazate pe asigurări [28]. În al doilea rând, toate tumorile au fost supuse testării MMR-IHC, MSI și MLH1-metilare și toate femeile, cu excepția unei femei, cu caracteristici tumorale indicative au fost supuse testării căii germinale_MMR. Acest lucru se compară favorabil cu majoritatea studiilor cu teste incomplete [13] și ne-a permis să testăm criteriile de selecție și strategiile de triere bazate pe tumori. În al treilea rând, toate analizele au fost efectuate conform unor standarde clinice asigurate de calitate în laboratoarele de referință specializate în patologie și genetică. În al patrulea rând, toate cu excepția a 2 dintre cele 106 (1,9%) tumori cu deficit de MMR au fost explicate prin hipermetilare MLH1, mutație somatică MMR sau LS. În al cincilea rând, includerea noastră de AH, parte a spectrului LS-EC [36], este neobișnuită, dar justificată, deoarece identificarea LS la femeile cu AH nu numai că sprijină viitoarele intervenții de reducere a riscurilor, ci are și impact asupra deciziilor lor imediate de tratament.

Descoperirile noastre susțin screeningul neselectat al EC pentru LS. Arătăm că vârsta, istoricul familial și descoperirile patologice au o valoare limitată în selectarea femeilor pentru testare. Testarea universală a liniei germinale nu este fezabilă din punct de vedere financiar [37], impunând triajul bazat pe tumori. Cea mai bună modalitate de a realiza acest lucru este controversată, dar înțelepciunea predominantă este că MSI și IHC sunt echivalente [29], în ciuda dovezilor limitate care să susțină acest lucru [15]. Datele noastre oferă dovezi puternice că MMR-IHC cu testarea MLH1-metilare țintită este superioară testelor bazate pe MSI în EC. Reduce proporția femeilor care necesită secvențierea liniei germinale fără a lipsi niciun caz, scăderea costurilor [37] și îmbunătățirea rentabilității [38, 39]. Identificarea EC deficitară în MMR este de importanță clinică. Permite clinicienilor să adapteze tratamentele [40], să explice prognosticul [40], să prezică reapariția cancerului [41] și să individualizeze urmărirea [41]. Mai mult, femeile vor să fie testate; este izbitor faptul că 99% dintre femeile eligibile abordate în timpul îngrijirii ginecologice de rutină pentru cancer au fost de acord să participe, iar 10/11 purtători LS nou identificați au participat la consiliere genetică și au susținut testarea în cascadă a membrilor familiei cu risc.

Screeningul neselectat al EC pentru LS duce la descoperirea VUS_MMR. Acestea creează o enigmă clinică, deoarece noile variante pot fi dificile de clasificat. Într-adevăr, 15 dintre cele 27 de variante MMR nu au fost raportate anterior nici seturilor de date ClinVar, nici InSiGHT. Acest lucru evidențiază necesitatea unor echipe internaționale de experți multidisciplinari pentru a explora semnificația clinică a VUS_MMR și/sau investițiile în platformele de editare a genomului de saturație pentru analiza de mare randament [15]. O astfel de infrastructură este stabilită pentru interpretarea variantelor MMR și trebuie ca toate laboratoarele clinice să interpreteze variantele conform unui singur set de criterii definite (https://www.insight-group.org/criteria/) înainte ca screeningul universal pentru LS în EC să înceapă cu seriozitate.

Din câte știm, acesta este cel mai cuprinzător studiu până în prezent care explorează prevalența LS într-o populație CE neselectată tratată într-un sistem de sănătate care nu este bazat pe asigurări. Consimțământul pentru testarea LS a fost luat de ginecologi în timpul îngrijirii clinice de rutină [42]. În această cohortă, am constatat că IHC depășește MSI ca un mijloc de triaj bazat pe tumori și identifică în mod fiabil atât tumorile germinale cât și tumorile cu deficit MMR somatic pentru a informa îngrijirea clinică. Prevalența globală a LS în EC a fost de 3,2%, ceea ce este comparabil cu cel al CRC [30] și justifică o recomandare similară pentru screeningul neselectat al LS. Aprobăm, atunci când resursele permit acest lucru, screeningul universal al EC pentru LS utilizând IHC, testarea MLH1-metilare direcționată și, acolo unde este indicat, secvențierea liniei germinale pentru variantele path_MMR.