Legate de

Preparate de probă Western blot, inclusiv tampoane de liză, lizat din cultura celulară, lizat din țesuturi și determinarea concentrației de proteine.

Conținutul protocolului de pregătire a probelor

  • Tampoane de liză
  • Inhibitori de protează și fosfatază
  • Prepararea lizatului din cultura celulară
  • Prepararea lizatului din țesuturi
  • Determinarea concentrației de proteine
  • Pregătirea probelor pentru încărcarea în geluri: denaturate și native, reduse și non-reduse

Tampoane de liză

Tampoanele de liză diferă prin capacitatea lor de a solubiliza proteinele, cu cele care conțin dodecil sulfat de sodiu (SDS) și alți detergenți ionici considerate a fi cele mai dure și, prin urmare, cele mai susceptibile de a oferi cel mai mare randament.

pregătirea

Considerentul principal la alegerea unui tampon de liză este dacă anticorpul ales va recunoaște probele denaturate. Atunci când acest lucru nu este cazul, va fi notat pe foaia tehnică a anticorpilor și trebuie folosite tampoane fără detergent sau cu detergenți neionici relativ ușori (NP-40, Triton X-100).

Localizarea proteinelor și alegerea tamponului de liză

Localizarea proteinelorSe recomandă tampon
Întregă celulăNP-40
Citoplasmatic (solubil)Tris-HCI
Citoplasmatic (legat de cito-schelet)Tris-Triton
Legat de membranăNP-40 sau RIPA
NuclearRIPA sau utilizați protocolul de fracțiune nucleară *
MitocondriileRIPA sau utilizați protocolul fracției mitocondriale *

* Proteinele care se găsesc exclusiv sau predominant într-o locație subcelulară vor fi mai îmbogățite într-un lizat al fracției subcelulare în comparație cu celulele întregi sau lizatele tisulare. Acest lucru poate fi util atunci când se încearcă obținerea unui semnal pentru o proteină slab exprimată. Vă rugăm să consultați protocoalele noastre separate pentru fracționarea sub-celulară.

Rețete tampon Lysis:

  • 150 mM clorură de sodiu
  • 1,0% NP-40 (Triton X-100 poate fi substituit cu NP-40)
  • 50 mM Tris pH 8,0

Acesta este un tampon popular pentru studiul proteinelor care sunt citoplasmatice sau legate de membrană sau pentru extracte de celule întregi. Dacă există îngrijorarea că proteina de interes nu este extrasă complet din material insolubil sau agregate, tamponul RIPA poate fi mai potrivit deoarece conține detergenți ionici care vor aduce mai ușor proteinele în soluție.

Tampon RIPA (tampon de test radioimunoprecipitare)

  • 150 mM clorură de sodiu
  • 1,0% NP-40 sau Triton X-100
  • 0,5% deoxicolat de sodiu *
  • 0,1% SDS (dodecil sulfat de sodiu)
  • 50 mM Tris, pH 8,0

* Poate fi preparat ca o soluție stoc de 10%, care trebuie protejată de lumină.

Tamponul RIPA este util pentru extracte de celule întregi și proteine ​​legate de membrană și poate fi preferabil tampoanelor NP-40 sau Triton X-100 numai pentru extragerea proteinelor nucleare. Va perturba interacțiunile proteină-proteină și, prin urmare, poate fi problematică pentru imunoprecipitații și analize de tip pull-down.

În cazurile în care este important să se păstreze interacțiunile proteină-proteină sau să se minimizeze denaturarea, trebuie utilizat un tampon fără detergenți ionici (de exemplu SDS) și, în mod ideal, fără detergenți neionici (de exemplu, Triton X-100).

Liza celulară cu tampon fără detergent se realizează prin forfecare mecanică, adesea cu un omogenizator Dounce sau prin trecerea celulelor printr-un tip de seringă. În aceste cazuri, un tampon Tris simplu va fi suficient, dar așa cum s-a menționat mai sus, sunt necesare tampoane cu detergenți pentru a elibera proteinele legate de membrană sau citoschelet.

    20 mM Tris-HCI, pH 7,5

Tampon Tris-Triton (proteine ​​cito-scheletice)

  • 10 mM Tris, pH 7,4
  • 100 mM NaCI
  • 1 mM EDTA
  • 1 mM EGTA
  • 1% Triton X-100
  • 10% glicerol
  • 0,1% SDS
  • 0,5% deoxicolat

Toate aceste patru tampoane se vor menține la 4 ° C timp de câteva săptămâni sau până la un an dacă sunt împărțite în alicote și depozitate la -20 ° C.


Inhibitori de protează și fosfatază

De îndată ce apare liza, începe proteoliza, defosforilarea și denaturarea. Aceste evenimente pot fi încetinite semnificativ dacă eșantioanele sunt păstrate pe gheață sau la 4 ° C în orice moment și se adaugă inhibitori adecvați în tamponul de liză.

Sunt disponibile cocteiluri gata de utilizare de inhibitori de la diverși furnizori, dar vă puteți crea propriul cocktail.

InhibitorProtează /
fosfatază
inhibat		Concentrația finală în tamponul de lizăStoc (magazin la -20 ° C)
AprotininTripsină, chimotripsină, plasmină2 μg/mlSe diluează în apă, 10 mg/ml. Nu reutilizați alicote dezghețate.
LeupeptinaLizozomal5-10 µg/mLSe diluează în apă. Nu reutilizați alicote dezghețate.
Pepstatin AProteaze aspartice1 μg/mlSe diluează în metanol, 1 mM.
PMSFSerină, cisteină proteaze1 mMSe diluează în etanol. Puteți reutiliza aceeași alicotă.
EDTAMetaloproteazele care necesită Mg 2+ și Mn 2+ 5 mMSe diluează în dH2O, 0,5 M. Reglați pH-ul la 8,0.
EGTAMetaloproteazele care necesită Ca 2+ 1 mMSe diluează în dH2O, 0,5 M. Reglați pH-ul la 8,0
Fluorură de sodiuFosfataze serină/treonină5-10 mMSe diluează în apă. Nu refolosiți după dezghețare.
Sodiu
ortovanadat		Tirozin fosfataze1 mMSe diluează în apă. Nu refolosiți după dezghețare.

Preparat ortovanadat de sodiu

Efectuați toți pașii într-o hotă de fum.

  1. Pregătiți o soluție de 100 mM în apă dublă distilată.
  2. Setați pH-ul la 9,0 cu HCI.
  3. Se fierbe până se incolorează. Minimizați schimbarea volumului datorită evaporării prin acoperirea liberă.
  4. Se răcește la temperatura camerei.
  5. Setați din nou pH-ul la 9,0.
  6. Se fierbe până se incolorează.
  7. Repetați acest ciclu până când soluția rămâne la pH 9,0 după fierbere și răcire.
  8. Aduceți volumul inițial cu apă.
  9. A se păstra în alicote la -20 ° C. Aruncați dacă probele devin galbene.


Prepararea lizatului din cultura celulară

  1. Așezați vasul de cultură celulară pe gheață și spălați celulele cu PBS rece ca gheața.
  2. Aspirați PBS, apoi adăugați tampon de liză rece cu gheață (1 mL la 10 celule/vas de 100 mm/balon de 150 cm 2; 0,5 mL la 5x10 6 celule/vas de 60 mm/balon de 75 cm 2).
  3. Răsturnați celulele aderente de pe vas folosind un răzuitor de celule din plastic rece, apoi transferați ușor suspensia de celule într-un tub de microcentrifugă pre-răcit. Alternativ, celulele pot fi tripsinizate și spălate cu PBS înainte de resuspendarea în tampon de liză într-un tub de microcentrifugă.
  4. Mențineți o agitare constantă timp de 30 de minute la 4 ° C.
  5. Centrifugați într-o microcentrifugă la 4 ° C. Este posibil să trebuiască să modificați forța de centrifugare și timpul în funcție de tipul de celulă; un ghid este de 20 de minute la 12.000 rpm, dar acest lucru trebuie stabilit pentru experimentul dvs. (de exemplu, leucocitele au nevoie de o centrifugare foarte ușoară).
  6. Scoateți ușor tuburile din centrifugă și puneți-le pe gheață, aspirați supernatantul și puneți-le într-un tub proaspăt păstrat pe gheață și aruncați peleta.


Prepararea lizatului din țesuturi

  1. Disecați țesutul de interes cu instrumente curate, de preferință pe gheață și cât mai repede posibil pentru a preveni degradarea prin proteaze.
  2. Așezați țesutul în tuburi de microcentrifugă cu fund rotund sau tuburi Eppendorf și scufundați-le în azot lichid pentru a îngheța. Depozitați probele la -80 ° C pentru utilizare ulterioară sau păstrați-le pe gheață pentru omogenizare imediată.
  3. Pentru o

5 mg bucată de țesut, adăugați

300 μL de tampon de liză rece cu gheață către tub, se omogenizează cu un omogenizator electric, se clătește lama de două ori cu încă 2 x 300 μL tampon de liză, apoi se menține o agitare constantă timp de 2 ore la 4 ° C (de exemplu, se pune pe un agitator orbital în frigiderul). Volumele tamponului de liză trebuie determinate în raport cu cantitatea de țesut prezentă. Extractul de proteine ​​nu trebuie diluat prea mult pentru a evita pierderea de proteine ​​și volumele mari de probe care trebuie încărcate pe geluri. Concentrația minimă recomandată este de 0,1 mg/mL, concentrația optimă este de 1-5 mg/mL).

  • Centrifugați timp de 20 de minute la 12.000 rpm la 4 ° C într-o microcentrifugă. Scoateți ușor tuburile din centrifugă și puneți-le pe gheață, aspirați supernatantul și puneți-le într-un tub proaspăt păstrat pe gheață. Aruncați peleta.


    • Determinarea concentrației de proteine

    1. Efectuați un test Bradford, un test Lowry sau un test bicinchoninic acid (BCA). Albumina serică bovină (BSA) este un standard proteic frecvent utilizat.
    2. Odată ce ați determinat concentrația fiecărei probe, le puteți congela la -20 ° C sau -80 ° C pentru utilizare ulterioară sau vă puteți pregăti pentru imunoprecipitare sau pentru încărcare pe un gel.


    Pregătirea probelor pentru încărcarea în geluri

    Eșantioane denaturate, reduse

    Anticorpii recunosc în mod obișnuit o mică porțiune a proteinei de interes (denumită epitop) și acest domeniu poate rezida în conformația 3D a proteinei. Pentru a permite accesul anticorpului la această porțiune este necesar să se desfășoare proteina, adică să o denaturăm.

    Pentru denaturare, utilizați un tampon de încărcare cu detergent anionic sodic dodecil sulfat (SDS) și fierbeți amestecul la 95-100 ° C timp de 5 min. Încălzirea la 70 ° C timp de 5-10 min este de asemenea acceptabilă și poate fi preferabilă atunci când se studiază proteinele din membrană cu trecere multiplă. Acestea tind să se agregeze atunci când sunt fierte și este posibil ca agregatele să nu intre în gel în mod eficient.

    Tamponul standard de încărcare se numește tampon Laemmli 2X (Laemmli Marea Britanie, 1970. Scindarea proteinelor structurale în timpul asamblării capului batteriofagului T4. Nature, 227, 680-5). Poate fi realizat și la rezistențe de 4X și 6X pentru a minimiza diluarea probelor. 2X trebuie amestecat în raport 1: 1 cu proba.

    2x rețetă tampon Laemmli

    • 4% SDS
    • 2% 2-mercaptoetanol
    • 20% glicerol
    • 0,004% albastru de bromofenol
    • Tris HCI 0,125 M
    • Verificați pH-ul și aduceți-l la pH 6,8

    Când SDS este utilizat cu proteine, toate proteinele devin încărcate negativ prin atașarea lor la anioni SDS. SDS se leagă de proteine ​​destul de specific într-un raport de masă de 1,4: 1. Procedând astfel, SDS conferă o încărcătură negativă polipeptidei proporțional cu lungimea sa. Polipeptidele denaturate devin tije cu sarcină negativă cu densități de sarcină egale pe unitate de lungime. Prin urmare, migrația este determinată de greutatea moleculară, mai degrabă decât de sarcina intrinsecă a polipeptidei.

    Gradul SDS este important pentru separarea proteinelor de înaltă calitate: un fond colorat cu proteine ​​de-a lungul tracturilor individuale de gel cu benzi proteice indistincte sau ușor distincte sunt indicative ale SDS vechi sau de calitate slabă. Includerea 2-mercaptoetanolului sau ditiotreitolului în tampon reduce punțile disulfurice, care este necesară pentru separarea în funcție de dimensiune.

    Glicerolul este adăugat la tamponul de încărcare pentru a crește densitatea probei de încărcat și, prin urmare, pentru a menține proba la fundul puțului, limitând preaplinul și încărcarea inegală a gelului.

    Pentru a vizualiza migrația proteinelor este obișnuit să se includă o mică moleculă de colorant anionic în tamponul de încărcare (de exemplu, albastru de bromofenol). Deoarece colorantul este anionic și mic, acesta va migra cel mai rapid dintre orice component din amestec pentru a fi separat și va oferi un front de migrare pentru a monitoriza progresul separării.

    În timpul tratamentului eșantionului de proteine, proba trebuie amestecată prin agitare înainte și după etapa de încălzire pentru o rezoluție optimă.

    Eșantioane native și non-reduse

    Alternativ, un anticorp poate recunoaște un epitop format din aminoacizi care nu sunt contiguați. Deși aminoacizii epitopului sunt separați unul de altul în secvența primară, sunt apropiați unul de celălalt în structura tridimensională pliată a proteinei, iar anticorpul va recunoaște epitopul doar așa cum există pe suprafața structura pliată.

    În aceste condiții, este important să rulați un western blot în condiții care nu denaturează, iar acest lucru va fi menționat în foaia tehnică din secțiunea aplicații. În general, o condiție care nu denaturează înseamnă pur și simplu să lăsați SDS în afara eșantionului și tampoanelor de migrare și să nu încălziți eșantioanele.

    Anumiți anticorpi recunosc doar proteinele în forma sa nededusă (în special asupra reziduurilor de cisteină) și agenții reducători β-mercaptoetanol și DTT trebuie lăsați în afara tamponului de încărcare și tampon de migrare.

    Starea proteinelorStarea geluluiSe încarcă tamponTampon de migrare
    Redus, denaturatReducerea și denaturareaCu 2-mercaptoetanol sau TDT și SDSCu SDS
    Redus, nativReductor și nativCu 2-mercaptoetanol sau TDT și SDSFără SDS
    Oxidat, denaturatNereducător și denaturantNr. 2-mercaptoetanol sau DTT, cu SDSCu SDS
    Oxidat, nativNereducător și nativNr. 2-mercaptoetanol sau DTT, cu SDSFără SDS

    Regula generală: reduceți și denaturați, cu excepția cazului în care foaia tehnică specifică altfel.

    Protocoalele sunt furnizate de Abcam „AS-IS” pe baza experimentării în laboratoarele Abcam folosind reactivi și produse Abcam; rezultatele dvs. de la utilizarea protocoalelor în afara acestor condiții pot varia.