Giuseppe Tatulli

1 IRCCS San Raffaele La Pisana, Roma, Italia

postul

Nico Mitro

2 Departamentul de Științe Farmacologice și Biomoleculare, Universitatea din Milano, Milano, Italia

Stefano M. Cannata

3 Departamentul de Biologie, Universitatea din Roma Tor Vergata, Roma, Italia

Matteo Audano

2 Departamentul de Științe Farmacologice și Biomoleculare, Universitatea din Milano, Milano, Italia

Donatella Caruso

2 Departamentul de Științe Farmacologice și Biomoleculare, Universitatea din Milano, Milano, Italia

Giovanna D’Arcangelo

4 Departamentul de sisteme medicale, Universitatea din Roma Tor Vergata, Roma, Italia

Daniele Lettieri-Barbato

1 IRCCS San Raffaele La Pisana, Roma, Italia

3 Departamentul de Biologie, Universitatea din Roma Tor Vergata, Roma, Italia

Katia Aquilano

1 IRCCS San Raffaele La Pisana, Roma, Italia

3 Departamentul de Biologie, Universitatea din Roma Tor Vergata, Roma, Italia

Date asociate

Abstract

Introducere

Vârsta avansată este factorul de risc major pentru tulburările metabolice și neurodegenerative (Zierer și colab., 2015). Dovezile din studiile clinice și din cercetările de bază indică faptul că disfuncția metabolică și declinul funcției creierului sunt legate de cauzalitate. Diabetul zaharat de tip 2 pare a fi un factor de risc sever pentru dezvoltarea demenței și a bolilor neuromotorii, inclusiv a bolii Parkinson (PD; Athauda și Foltynie, 2016). Interesant este că rezistența la insulină la pacienții cu PD este asociată cu o progresie mai severă a bolii (Athauda și Foltynie, 2016), iar rezistența la insulină a fost propusă ca un bun predictor al declinului cognitiv la om (Ekblad și colab., 2017). În modelele experimentale, un astfel de fenomen pare a fi cauzat de creșterea degenerării neuronilor dopaminergici. De fapt, supraîncărcarea de grăsime în modelele murine de PD exacerbează neurodegenerarea prin stimularea depunerii de fier și a modificărilor specifice ale ganglionilor bazali în substanța neagră (SN) care duc la afectarea funcției dopaminei nigrostriatale (Morris et al., 2011; Rotermund et al., 2014).

Toate aceste descoperiri îi determină pe cercetători să studieze dacă reducerea aportului de calorii prin restricție calorică sau strategii dietetice bazate pe post ar putea preveni neurodegenerarea. Evenimentele moleculare activate de post sunt conservate de la drojdie la om și împărtășesc capacitatea de a proteja funcția creierului și sănătatea metabolică (Lettieri Barbato și colab., 2012, 2015; Lettieri Barbato și Aquilano, 2016). Postul intermitent (IF) este un termen generic folosit pentru a descrie diferite forme de post, cum ar fi postul alternativ de zi, postul periodic, postul controlat în timp. Dovezile experimentale demonstrează un rol preventiv al IF în declinul cognitiv și în multe tulburări neurodegenerative, inclusiv PD atât la rozătoare, cât și la om (Anton și Leeuwenburgh, 2013; Wahl și colab., 2016; Mattson și colab., 2017).

Substanțele chimice de mediu reprezintă factori de risc pentru bolile neurodegenerative, inclusiv PD (Cannon și Greenamyre, 2011). Majoritatea cazurilor de PD sunt expunere sporadică și cronică la pesticide, cum ar fi inhibitorii complexi I rotenona (Rot), pot juca un rol major în patogenie (Ascherio și Schwarzschild, 2016). Dacă IF poate fi protector și în această paradigmă, este în prezent nedefinit. Aici, am caracterizat efectul IF în modularea metabolismului creierului și a degenerescenței neuronilor dopaminergici prin utilizarea abordărilor metabolomice. În special, am tratat șoarecii cu Rot în combinație cu IF. Rot este capabil să inducă degenerescența selectivă a neuronilor dopaminergici și a trăsăturilor asemănătoare PD la animale (Inden și colab., 2011; Tanner și colab., 2011). Am constatat că IF de o lună nu a fost suficient pentru a induce modificări metabolice în SN; cu toate acestea, IF a agravat degenerescența dopaminergică mediată prin rot, care a fost asociată cu fosfolipide inflamatorii crescute și niveluri excitante de aminoacizi.

Materiale și metode

Șoareci și tratamente

Rotarod

Analizele Rotarod au fost efectuate pentru a testa latența șoarecilor să scadă pentru a evalua efectele asupra coordonării motorii. Analizele Rotarod au fost efectuate atât la momentul inițial înainte de prima administrare a rotenonei (neincluse în rezultate), cât și cu 2 zile înainte de sfârșitul tratamentului (în ziua de post și administrarea anterioară a rotenonei). Șoarecii au fost așezați pe rotarod (pentru șoareci, Cat N ° 47600, Ugo Basile s.r.l., Italia) și testați secvențial la viteze diferite de la 7 rpm la 25 rpm. Când șoarecii au simțit rotarodul, au fost așezați pe el pentru timpul rămas. În zilele de testare, fiecare șoarece a efectuat un pre-proces (care nu a fost inclus în rezultate) pentru a permite șoarecilor să se obișnuiască cu rotarodul. Procesul a fost efectuat după 2 ore de odihnă.

Imunohistochimie

Creierele intacte au fost îndepărtate și imersate în soluția de fixare Carnoy (60% etanol, 30% cloroform și 10% acid acetic glacial) peste noapte la 4 ° C. Creierele au fost deshidratate cu trei spălări în EtOH absolut, eliminate cu trei spălări de Histoclear și încorporate în parafină. Regiunea dopaminergică a fost identificată începând de la aproximativ Bregma -4,30 mm până la Bregma -2,63 mm conform Allen Mouse Brain Atlas. Această zonă a fost tăiată în secțiuni transversale de 25 μm cu un microtom rotativ Leitx. Șaptezeci de secțiuni au fost plasate pe 13 diapozitive pentru a avea serii posterioare-anterioare complete și diapozitive consecutive cu secțiuni adiacente. Diapozitivele au fost colorate cu anticorp policlonal tirozin-hidroxilază (TH) (diluat 1: 100, sc-14007 Santa-Cruz Biotechnologies) sau anticorp monoclonal alfa-sinucleină (α-syn) (diluat 1: 100, ab138501 Abcam). Au fost apoi folosiți anticorpi secundari conjugați cu HRP (1: 300 Bio-Rad) și aminoetilcarbazonă (kit AEC, Sigma-Aldrich) ca substrat cromogen HRP.

Neuronii TH-pozitivi și zonele TH-pozitive au fost obținute utilizând ImageJ (Schneider și colab., 2012); suma fiecărei zone a fost înmulțită cu grosimea lamelelor (25 μm) pentru a obține volumul de SN. Imunomarcarea α-syn a fost cuantificată optic pentru fiecare lamă utilizând software-ul ImageJ conform Mulcahy și colab. (2012). Pe scurt, valorile medii de gri ale regiunilor colorate și nepătate (de fundal) au fost calculate și convertite în densități optice prin aplicarea formulei de conversie în ImageJ (densitate optică = log10 (255/valoare medie de gri). Densitățile optice finale au fost calculate ca diferență pentru a asigura acuratețea datelor, au fost efectuate simultan proceduri imunohistochimice pe fiecare probă și toate imaginile capturate utilizând microscopul Axiolab A1 Zeiss conectat la o cameră digitală (Axiocam ICC5) în aceleași condiții de câmp luminos iluminarea și timpul de expunere.

Metabolomica

SN au fost resuspendate și lizate în MeOH/ACN 1: 1 și filate la 20.000 g timp de 5 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost salvat pentru analiza ulterioară. Cuantificarea aminoacizilor a fost realizată prin derivatizare anterioară. Pe scurt, 50 pl de fenil izotiocianat de 5% (PITC) în 31,5% EtOH și 31,5% piridină în apă au fost adăugați la 10 pl din fiecare probă. Amestecurile au fost apoi incubate cu soluție de PITC timp de 20 min la RT, uscate sub flux N2 și suspendate în 100 μl de acetat de amoniu 5 mM în MeOH/H2O 1: 1.

Datele metabolomice au fost efectuate pe un spectrometru de masă API-4000 triplu quadrupol (AB SCIEX) cuplat cu un sistem HPLC (Agilent) și un sampler automat CTC-PAL-HTS (Sistem PAL). Identitatea tuturor metaboliților a fost confirmată folosind standarde pure. Cuantificarea diferiților aminoacizi a fost efectuată utilizând o coloană C18 (Biocrates). Probele metanolice au fost analizate printr-o cursă de 10 minute în modul ion pozitiv cu o tranziție de monitorizare a reacției multiple 20 (MRM). Fazele mobile pentru analiza modului ion pozitiv (aminoacizi) au fost faza A: 0,2% acid formic în apă și faza B: 0,2% acid formic în acetonitril. Gradientul a fost T0 100% A, T5 5 min 5% A, T7 min 100% A cu un debit de 500 μl/min. Software-ul MultiQuant ™ (versiunea 3.0.2) a fost utilizat pentru analiza datelor și revizuirea maximă a cromatogramelor. Evaluarea cantitativă a tuturor metaboliților a fost efectuată pe baza curbelor de calibrare cu standarde pure, iar apoi datele au fost normalizate cu privire la conținutul de proteine.

Profil fosfolipidic prin analiza injecției de flux - Spectrometrie de masă tandem (FIA-MS/MS)

Cuantificarea acizilor grași totali a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Cermenati și colab., 2017). Pe scurt, cuantificarea diferitelor familii de fosfolipide a fost realizată prin metoda de analiză a injecției de flux-spectrometrie de masă tandem (FIA-MS/MS). Identitatea diferitelor familii de fosfolipide a fost confirmată folosind standarde pure, și anume unul pentru fiecare familie. Extractele metanolice au fost analizate printr-o cursă de 3 minute atât în ​​modul ion pozitiv cât și negativ cu o tranziție 268 MRM în modul pozitiv și 88 MRM tranziție în modul negativ. A fost utilizată o sursă ESI conectată cu un instrument triplu cvadrupolar API 4000 (AB Sciex, Framingham, MA, SUA). Faza mobilă a fost 0,1% acid formic în MeOH pentru analiza FIA pozitivă și 5 mM acetat de amoniu pH 7 în MeOH pentru FIA negativ. Software-ul MultiQuant ™ versiunea 3.0.2 a fost utilizat pentru analiza datelor și revizuirea maximă a cromatogramelor. Evaluarea semiquantitativă a familiilor PL a fost realizată pe baza standardelor externe.

Analize statistice

Semnificația statistică a diferențelor dintre valorile medii ale eșantionului de grup a fost determinată de analiza varianței (ANOVA), urmată de testul Student-Newman-Keuls pentru compararea pereche a mediilor. Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând software-ul GraphPad Prism 5 (Software GraphPad). Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD. Diferențele au fost considerate semnificative la p (Figura 1A). 1A). Aceste descoperiri sunt în concordanță cu lucrările anterioare care dezvăluie efectul de slăbire a IF (Lettieri-Barbato și colab., 2016). În schimb, nu au fost observate modificări ale greutății creierului și ale altor organe, cum ar fi ficatul și inima (datele nu sunt prezentate). Analizele bioclinice raportate în Tabelul Tabelul 1 1 au arătat că toate grupurile nu au manifestat modificări metabolice, după cum s-a evaluat prin analiza glicemiei în post, a colesterolului din sânge și a trigliceridelor. De asemenea, analiza creatininei din sânge, CPK, ALT, GOT a indicat faptul că leziunile renale, musculare scheletice și hepatice nu au fost induse. Analiza nivelurilor serice de IGF-1 a arătat că acestea au scăzut atât în ​​grupurile IF, cât și în grupurile Rot/IF în raport cu grupurile Ctr și Rot (Tabelul (Tabelul 1). 1). Acest rezultat a confirmat eficacitatea IF, deoarece nivelurile reduse de IGF-1 se găsesc la diferite regimuri de restricție dietetică la rozătoare și la om (Mitchell și colab., 2010; Lettieri-Barbato și colab., 2016).