Abstract

Scopul acestui studiu a fost de a investiga dacă nanoparticulele fotocatalitice de TiO2 au un efect adjuvant, atunci când sunt administrate în asociere cu ovalbumină (OVA) la șoareci. Șoarecii au fost imunizați prin injecții intraperitoneale de OVA, OVA + TiO2 sau OVA + Al (OH) 3 și provocați cu aerosoli de OVA. La sfârșitul studiului, serul a fost analizat pentru conținutul de anticorpi IgE specifici OVA, IgG1 și IgG2a, iar lichidul de lavaj bronchoalveolar (BALF) a fost analizat pentru conținutul celulelor inflamatorii și nivelurile de interleukină (IL) -4, IL-5, IL-10 și interferon-γ. Particulele TiO2 au promovat un răspuns imun dominant Th2 cu niveluri ridicate de IgE și IgG1 specifice OVA în ser și aflux de eozinofile, neutrofile și limfocite în BALF. Particulele TiO2 au indus un nivel semnificativ mai ridicat de IgE specific OVA decât adjuvantul standard Al (OH) 3. Cu toate acestea, cele două substanțe au fost comparabile în ceea ce privește nivelul inflamației eozinofile și interleukinele prezente în BALF.

Studiile epidemiologice și de laborator au furnizat dovezi că expunerea la particule din mediul ambiant este asociată cu diverse efecte asupra sănătății, inclusiv inflamația căilor respiratorii [1,2], sensibilizarea alergică [3-7] și exacerbarea astmului [8,9]. Astfel, particulele de eșapament diesel pot crește sensibilizarea împotriva alergenilor atât la animale, cât și la oameni [6,7,10]. Recent, nanomaterialele create de om, inclusiv nanotuburile de carbon cu pereți unici și multi-pereți, precum și nanoparticulele din latex, s-au dovedit a promova sensibilizarea alergică [11], inflamația alergică a plămânilor [12,13] și fibroza căilor respiratorii [14].

Spre deosebire de ex. particulele de eșapament diesel și nanotuburile de carbon, particulele de dioxid de titan (TiO2) sunt, în general, acceptate ca fiind puțin toxice atât pentru oameni, cât și pentru animale [15-17]. Presupusa toxicitate scăzută a TiO2 se reflectă în utilizarea pe scară largă a acestui compus, de exemplu ca pigment în vopsele, alimente, medicamente și produse de protecție solară [18-20]. Particulele de TiO2 de dimensiuni micrometrice nu au prezentat niciun efect adjuvant atunci când au fost administrate șoarecilor în combinație cu ovalbumină (OVA) [21].

Pentru multe substanțe, inclusiv TiO2, o reducere a dimensiunii particulelor este asociată cu proprietăți pro-inflamatorii crescute [22] și daune oxidative în linia celulară epitelială bronșică umană [23]. Odată cu dezvoltarea nanotehnologiei și fabricarea produselor care conțin nanoparticule, cunoașterea rolului dimensiunii particulelor asupra toxicității este de o importanță crescândă. Doar un studiu anterior [21] a investigat efectul TiO2 de dimensiuni nanometrice asupra răspunsului imun la alergenul administrat simultan, dar particulele foarte fine cu compoziție foarte diferită au avut efect adjuvant într-un model de șoarece folosind OVA ca model alergen [24]. De asemenea, s-a demonstrat că efectul adjuvant al particulelor asupra sensibilizării alergice crește odată cu scăderea dimensiunii particulelor [21,25].

Unele dintre produsele de pulverizare de uz casnic „nano” nou comercializate cu proprietăți de autocurățare conțin TiO2 fotocatalitic de dimensiuni nano, motiv pentru care expunerile căilor respiratorii umane la astfel de particule pot crește. În mod similar, vopselele sunt adăugate în mod deliberat nanoparticulat TiO2 pentru a obține proprietăți îmbunătățite și efecte de autocurățare. Multe alte produse pot conține, de asemenea, nanoparticule de TiO2. Prezentul studiu a avut ca scop investigarea dacă TiO2 fotocatalitic de dimensiuni nanometrice are efect adjuvant și promovează sensibilizarea alergică atunci când este administrat în asociere cu OVA la șoareci.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii BALB/cJ femele consangvinizate în vârstă de 5-6 săptămâni au fost achiziționați de la Taconic M&B, Ry, Danemarca și au fost adăpostiți așa cum s-a descris anterior [26]. Tratamentul animalelor a urmat procedurile aprobate de The Animal Experiment Inspectorate, Danemarca.

Produse chimice

OVA de ou de pui (CAS 9006-59-1) a fost de gradul V (puritate ≥ 98%) de la Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA. Adjuvantul Al (OH) 3 provine de la Alhydrogel, Brenntag Biosector, Frederikssund, Danemarca.

TiO2 a fost VP Disp. W 2730 X de la Degussa AG (Frankfurt pe Main, Germania), acum Evonik Industries, care este o dispersie de 30% în greutate de TiO2 fumificat. Distribuția mărimii numărului de particule hidrodinamice a particulelor TiO2 a fost determinată prin spectroscopie de corelație a fotonilor utilizând un Zetasizer dinamic Zatter (Laser) (Malvern Inc., Malvern, Marea Britanie) echipat cu un laser He-Ne Clasa I de 4 mW, 633 nm . Rezultatele au fost calculate utilizând software-ul Dispersion Technology (DTS) versus 5.0 (Malvern Instruments Ltd.). TiO2 a fost suspendat în apă filtrată MilliQ de 0,45 μm, tratată cu ultrasunete și măsurată în cuve de polistiren de 1 ml de unică folosință. Pentru calcule, am folosit indicii de refracție (Ri) și de absorbție (Rs) pentru TiO2 rutil (Ri = 2.903; Rs = 0.100) și proprietățile standard pentru H2O. Densitatea TiO2 a fost stabilită la 4,25 g/cm3 .

Proceduri de imunizare și provocare a căilor respiratorii

Șoarecii (n = 7-8 pe grup) au fost imunizați în principal în ziua 0 cu 1 μg OVA singur sau cu 1 μg OVA în combinație cu 2, 10, 50 sau 250 μg TiO2 intraperitoneal (i.p.). Un grup care a primit 1 μg OVA în combinație cu 270 μg Al (OH) 3 a servit drept control adjuvant pozitiv.

În zilele 13 și 20, toți șoarecii au primit o injecție de rapel conținând 0,1 μg OVA i.p. (fig. 1).

dioxid

Protocolul de studiu. Pentru detalii, conferiți secțiunea Materiale și metode.

Pentru a evita aglomerarea ulterioară a particulelor, suspensia de TiO2 hidrat a fost diluată în apă sterilă, fără pirogeni, ca vehicul. Soluție salină fără pirogeni a fost utilizată pentru injecții de rapel în care OVA a fost administrat fără particule.

În zilele 27 și 34, toți șoarecii au fost provocați 20 de minute. cu un aerosol de soluție 1% OVA în soluție salină.

Experimentul a fost încheiat în ziua 35. Probele de sânge au fost colectate prin puncție cardiacă urmată de spălare bronhoalveolară (BAL) așa cum s-a descris anterior [26].

Sera a fost testată pentru conținutul de IgE, IgG1 și IgG2a specifice OVA. Măsurarea IgE a fost efectuată folosind un kit comercial ELISA IgE (OVA-IgE96 MD Biosciences, St Paul, MN, SUA) conform descrierii producătorului. IgG1 și IgG2a au fost analizate așa cum s-a descris anterior [27]. Nivelurile de interleukină (IL) -4, IL-5, IL-10 și interferon (IFN) -γ în fluidele BAL au fost analizate de kituri ELISA (eBioscience, San Diego, CA, SUA) conform descrierii producătorului.

Statistici

Nivelurile de anticorpi, numărul de celule inflamatorii și nivelurile de citokine din lichidul BAL în cele patru grupuri TiO2 au fost comparate cu grupul de control OVA prin testul Kruskal - Wallis. Dacă a fost evidentă o diferență semnificativă statistic, grupurile individuale de TiO2 au fost comparate în continuare cu grupul de control OVA prin testul U al lui Mann-Whitney. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic. Calculele au fost efectuate utilizând software-ul statistic Minitab, versiunea 14 Xtra (Minitab Inc., State College, PA, SUA).

Rezultate

Caracterizarea particulelor

Analiza Dynamic Laser Scatter a arătat că spectrul de dimensiuni al particulelor de TiO2 tratate cu ultrasunete suspendate în apa filtrată MilliQ a fost puternic dominat de particule de dimensiuni nano (Fig. 2). În distribuția mărimii numărului, a arătat că un singur vârf modal a avut loc în jurul valorii de 28 nm. Grafic în volum, s-a rezolvat o distribuție polimodală a dimensiunii cu particule submicronice mai grosiere, obținând o dimensiune medie zeta de 140,04 ± 1,36 nm (indicele polidispersivității: 0,22). Cu toate acestea, chiar și în volum, mai mult de 50% din particule au fost mai mici de 100 nm. Acest lucru este de acord cu specificațiile producătorului care susțin că dimensiunea agregată medie (d-50) a fost sub 100 nm.

Numărul hidrodinamic și distribuția volumului volumului TiO2 fotocatalitic (0,05 mg/ml) suspendat în apă filtrată MilliQ.

Suprafața particulelor a fost calculată ca fiind de 34,1 m 2/g.

Anticorpi specifici OVA în ser

Nivelurile IgE și IgG1 la cele trei doze mai mici de TiO2 nu au fost statistic diferite de grupul de control OVA. Cea mai mare doză de TiO2, 250 μg, a dat naștere la niveluri semnificativ crescute de IgE și IgG1 comparativ cu grupul de control OVA (Fig. 3). Grupul adjuvant Al (OH) 3 a dat naștere la un nivel semnificativ mai ridicat de IgG1, în timp ce creșterea IgE nu a fost semnificativă statistic în comparație cu grupul martor OVA. Mai mult, nivelul IgE, dar nu și IgG1 a fost semnificativ mai mare în 250 μg TiO2 în comparație cu grupul Al (OH) 3 (p = 0,009).

Niveluri de anticorpi specifici OVA în ser. Nivelul anticorpului este exprimat ca unități de concentrație arbitrară pentru IgG1. Pentru IgE, unitatea de concentrație este μg/10 ml. Datele sunt valori mediane cu percentila 75 a 7-8 șoareci. Nivelul crescut statistic de anticorp în comparație cu controlul OVA este prezentat ca * p fig. 4). Comparând răspunsurile în grupul de control adjuvant și grupurile de 250 μg TiO2 a relevat că numărul de neutrofile a fost semnificativ mai mare în grupul de control adjuvant, în timp ce nu s-a observat nicio diferență în ceea ce privește numărul de eozinofile, limfocite și macrofage.

Numărul de celule inflamatorii din lichidul de lavaj bronhoalveolar. Datele sunt valori mediane cu percentila 75 a 7-8 șoareci. Numărul de celule crescut statistic în comparație cu controlul OVA este prezentat ca * p fig. 5); cele mai ridicate niveluri de IL-4 și IL-5 au fost observate în grupul 250 μg TiO2 și grupul Al (OH) 3. Cu toate acestea, comparația pereche a grupurilor de expunere cu grupurile de control OVA nu a evidențiat diferențe semnificative, adică niciunul dintre grupurile individuale de expunere nu a diferit de grupul de control OVA.

Niveluri de IL-4 și IL-5 în lichidul de lavaj bronhoalveolar. Datele sunt valori medii cu S.E.M. din 7-8 șoareci.

IL-10 și IFN-γ au fost sub limitele de detecție în toate probele BAL (datele nu sunt prezentate).

Discuţie

Studiul nostru a arătat că nanoparticulele fotocatalitice TiO2 livrate ca suspendate în apă posedă efect adjuvant atunci când sunt administrate în combinație cu OVA la șoareci. Efectul adjuvant a fost sugerat din nivelurile IgE și IgG1, adică TiO2 primează un răspuns imun dominant Th2. Nanoparticulele fotocatalitice TiO2 au fost semnificativ mai puternice decât Al (OH) 3 pentru a stimula producția de IgE, în timp ce cei doi compuși au dat naștere unei creșteri aproximativ egale a producției de IgG1. Mai mult, TiO2 a crescut afluxul de celule inflamatorii în plămâni. Nivelul crescut de eozinofile susține în continuare că TiO2 stimulează un răspuns imun alergic. Administrarea a 250 μg TiO2 a dat naștere la o creștere de 5 ori a nivelului eozinofilelor, un răspuns comparabil cu cel indus de 270 μg Al (OH) 3. Deoarece IgE nu este semnificativ crescută în grupul Al (OH) 3, s-ar putea specula că inflamația eozinofilă observată în acest grup este, cel puțin parțial, determinată de anticorpul IgG1, care poate fi anafilactic la șoarece după expunerea la niveluri ridicate de alergeni [28.29].

În concluzie, deși particulele de TiO2 de dimensiuni micrometrice în general sunt considerate a fi relativ inerte din punct de vedere biologic, acest studiu a arătat că nanoparticulele de TiO2, care este o componentă în, de ex. produse de auto-curățare, are efect adjuvant la șoareci. Astfel, pentru TiO2, așa cum se arată pentru alte substanțe, evaluările riscului toxicologic bazate pe particule fine nu pot fi extinse pur și simplu la nanoparticule.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc pe Maria Hammer și Ulla Tegner pentru asistență tehnică. Această lucrare face parte din proiectul NANOKEM finanțat de Fondul național pentru mediu de lucru, Danemarca.