Jianning Tao

1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA

Shan Chen

1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA

Tao Yang

1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA

Brian Dawson

1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA

Elda Munivez

1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Baylor College of Medicine, Houston, TX, SUA

Terry Bertin

1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Baylor College of Medicine, Houston, TX, SUA

Brendan Lee

1 Departamentul de genetică moleculară și umană, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA

2 Institutul Medical Howard Hughes, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX, SUA

Abstract

Introducere

Remodelarea osoasă fiziologică este un proces specificat de un echilibru între formarea osoasă de către osteoblaste și resorbția osoasă de către osteoclaste. Un dezechilibru în remodelarea oaselor contribuie la mai multe afecțiuni patologice, inclusiv osteoscleroză, osteopetroză și osteoporoză. Se estimează că aceste condiții afectează zeci de milioane de oameni. Osteoscleroza este o tulburare osoasă caracterizată printr-o îngroșare anormală și o creștere progresivă a masei osoase a scheletului datorită unui număr crescut de osteoblaste.1 În schimb, osteopetroza rezultă dintr-o scădere primară a funcției osteoclastice.2 În prezent, factorii cauzali extrinseci (de exemplu, fluoroză) care sunt asociate cu osteoscleroza.3, 4, 5, 6 Cu toate acestea, rapoartele despre factorii genetici cauzali sau căile de semnalizare care sunt implicate în osteoscleroză au fost limitate.7, 8, 9, 10

De la debutul acestui deceniu până în prezent, studiile genetice umane au identificat mutații în multe componente ale căii de semnalizare Notch care cauzează defecte scheletice.14 De exemplu, mutațiile genei DLL3 și ulterior ale genelor MESP2 și LFNG au fost identificate ca cauzând disostoză spondilocostală (SCDO), o tulburare moștenită caracterizată prin formare și modelare vertebrală anormală. În același timp, studiile modelelor de șoarece mutante corespunzătoare ne-au mărit înțelegerea acestor defecte congenitale.15 În plus, semnalizarea aberantă Notch joacă un rol important în patogeneza leucemiei și a altor tipuri de cancer.16 Studiile intensive au identificat noi mutații de activare în Receptorul Notch1 care este responsabil pentru mai mult de 50% din eșantioanele de leucemie limfoblastică acută cu celule T umane (T-ALL). 20

Materiale și metode

Animale

Șoareci knockout condiționati Rbpj flox/flox, șoareci transgenici Col1a1 2.3 - kb Cre (TG Col1a12.3kbCre/+) și șoareci transgenici Rosa Notch (TG NICDflox/+) au fost descriși anterior.25, 26, 27 Acești șoareci au fost menținuți pe un fundal hibrid 129 × C57BL/6. Genotiparea PCR a fost efectuată așa cum a fost descris. Animalele au fost utilizate în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator. Toți șoarecii au fost adăpostiți într-o instalație specifică fără patogeni și în condiții controlate de lumină, temperatură și umiditate. Aceste studii au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Baylor College of Medicine.

Pregătirea scheletului și histologia

Preparatele scheletice montate în întregime colorate cu albastru alcian 8GX (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și roșu alizarină S (Sigma Aldrich) au fost preparate așa cum s-a descris anterior.21 Littermates of control, GOF mutant sau GOF: Rbpj f/șoarecii au fost eutanasiați la vârsta de 3 până la 8 săptămâni, iar scheletele întregi au fost fixate în formalină tamponată neutră 10% peste noapte. Am secționat oase decalcificate încorporate în parafină la o grosime de 6 - µm și am colorat secțiunea cu hematoxilină și eozină (H&E), albastru de toluidină și pete Goldner folosind protocoale standard. Preparatele scheletice ale membrelor au fost fotografiate cu o cameră digitală Nikon de 5,0 megapixeli montată deasupra unei lunete de disecție Nikon SMZ1500. Toate setările microscopului și ale camerei au fost identice pentru captarea tuturor imaginilor. Fișierele de imagine digitale au fost încărcate într-un software Axiovision (Carl Zeiss Vision, Munchen - Hallbergmoos, Germania) conectat la un scop Zeiss Axioplan 2, iar echivalența scării a fost realizată prin transferul informațiilor de calibrare a micrometrului de etapă. Aceste proceduri au permis compararea directă a fiecărei imagini.

Măsurători de tomografie micro-computerizată osoasă (µCT)

Am analizat osul trabecular al femurului distal printr-un sistem µCT (µCT - 40, Scanco Medical, Basserdorf, Elveția) folosind un protocol standard din nucleul µCT de la Colegiul de Medicină Baylor. Pe scurt, femurele de la șoareci de 8 săptămâni au fost disecate, curățate de țesut moale și fixate 2 zile în formalină tamponată 10% neutră și apoi depozitate în 70% etanol la 4 ° C. Osul trabecular a fost analizat la capătul distal al femurului începând de la capătul plăcii de creștere. Șaptezeci și cinci de felii care acoperă o lungime totală de 1,20 mm au fost evaluate în spongioza secundară la rezoluție înaltă. O valoare prag de 210 a fost utilizată pentru evaluarea 3D.

Extracția ARN și analiza cantitativă RT - PCR

Extracțiile de ARN, sintezele de ADNc în prima catenă și PCR în timp real au fost efectuate așa cum s-a descris anterior.21, 28 Pe scurt, am extras ARN total din calvaria șoarecilor în vârstă de 3 săptămâni (n = 4) cu reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Am sintetizat ADNc din ARN extras cu Superscript III First Strand RT - Kit PCR (Invitrogen). Am efectuat amplificări PCR cantitative în timp real într-un LightCycler (Roche, Indianapolis, IN, SUA). Am folosit genele care codifică GAPDH și β2 - microglobulină ca gene de referință pentru cantitatea și calitatea ADNc-urilor în teste PCR în timp real. Cantitatea relativă a fiecărui ARNm a fost determinată prin metoda CT comparativă.

analize statistice

Rezultatele sunt raportate ca valori medii ± SD. Semnificația statistică (valorile p) a fost calculată utilizând testul t Student. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.

Rezultate

Generarea șoarecilor bitransgenici Notch GOF activați cre

este

Creșterea funcțională a crestăturii determină osteoscleroză generalizată la șoarecii bitransgenici. Pregătirea scheletică a șoarecilor GOF de 4 săptămâni a arătat oase îngroșate ale unui fenotip osteosclerotic sever în craniu (A), coaste (B), vertebre cozii (C) și membrele anterioare (D). Preparatele scheletice au fost colorate cu albastru alcian și roșu alizarină.

Fenotipul osteosclerotic la șoarecii Notch GOF este reversibil. (A) reconstrucția µCT a femurelor distale (a, c) sau întregi (b) de la șoareci de 2 luni prezintă o scurtare la șoareci GOF comparativ cu șoareci martor sau GOF: Rbpj f/f. (d - f) O secțiune sagitală a femurului de la (a - c). Osul trabecular la șoarecii GOF a crescut (e), iar această modificare a scăzut la normal la șoarecii GOF: Rbpj f/f (f) comparativ cu martorul (d). Bară de scară = 1,0 mm. (B - E) Analize histomorfometrice osoase cantitative ale femurilor la martorii de 2 luni, GOF și GOF: șoareci Rbpj f/f (n = 5). Creșterea numărului trabecular (B), grosimea (C) și raportul volumului osos/volum al țesutului (BV/TV, E) și spațiul trabecular scăzut (D) la șoarecii GOF sunt inversate la șoarecii GOF: Rbpj f/f * fundal pf/f (panoul din dreapta) la un nivel similar controlului (panoul din stânga) Barele de scalare = 500 µm.

Consecințele îndepărtării genetice a căii Rbpj la șoarecii bitransgenici NICD

Adăugarea genetică a alelei Rbpj flox/flox salvează întârzierea creșterii și fenotipurile cozii perverse la șoarecii bitransgenici. (A) Schema de reproducere a șoarecilor GOF bitransgenici NICD cu șoareci Rbpj flox/flox. Acești șoareci GOF: Rbpj f/f au o alelă NICD activatoare și ștergerea Rbpj în osteoblaste comise. (B) Examinarea arată că șoarecii GOF la vârsta de 6 săptămâni au o greutate corporală semnificativ mai mică decât martorii și șoarecii GOF: Rbpj f/f (martor n = 12, GOF n = 8, GOF: Rbpj f/f n = 3). Șoarecii GOF: Rbpj f/f au greutăți similare cu comenzile. * șoareci p f/f. (C) Șoareci la vârsta de 6 săptămâni cu perechea de control, perechea GOF și perechea GOF: Rbpj f/f. Doar perechea GOF afișează dimensiuni mai mici ale corpului și coadă perversă (săgeată neagră). (D) Preparatele scheletice ale șoarecilor vechi de 6 săptămâni GOF: Rbpj f/f arată forma și dimensiunea scheletului normal al scheletului GOF: Rbpj f/f cu coada dreaptă. Control, GOF, GOF: Șoarecii Rbpj f/f sunt tovarăși de gunoi. Preparatele scheletice au fost colorate cu albastru alcian și roșu alizarină.

Analiza morfometrică și moleculară osoasă a osteoblastelor bitransgenice și salvate NICD

Pentru a determina dacă salvarea morfologică s-a corelat cu o salvare completă la nivel de țesut și molecular, am efectuat mai întâi analize morfometrice osoase prin imagistică µCT pe femururile de șoareci de 8 săptămâni de control, GOF și GOF: Rbpj f/f șoareci salvați. Distribuția osului trabecular și grosimea osului cortical în femurele salvate au fost comparabile cu cele ale șoarecilor martor (Fig. (Fig.4 4 A, d și f), dar semnificativ diferite de cele ale șoarecilor GOF (Fig. 4 4 A, e) Mai mult, volumul osului trabecular și parametrii morfometrici care măsoară numărul trabecular, grosimea și distanța au fost normalizați la femurele salvate în comparație cu femurele GOF (Fig. (Fig.4 4 B - E). Rezultatul colorării Goldner a femurilor în șoarecii GOF: Rbpj f/f au fost în concordanță cu cei din analiza µCT (Fig. (Fig.4 4 F). Astfel, aceste date sugerează că fenotipul tisular observat la șoarecii GOF este, de asemenea, inversat prin îndepărtarea semnalizării canonice Notch la osteoblaste.

Semnătura moleculară a osteosclerozei este inversată în osteoblastele GOF: Rbpj f/f. ARN total calvarial a fost obținut de la șoareci martor, GOF și GOF: Rbpj f/f la vârsta de 3 săptămâni (n = 4). Profilul transcripțional pentru markerii ciclului celular, osteoblast și osteoclastic a fost salvat: (A) qRT - PCR al markerilor ciclului celular ciclină D1, ciclină A1 și p53; (B) qRT - PCR a markerilor de diferențiere a macrofagelor și osteoclastelor osteoprotegerină, RANKL, ligand RANK, TRACP și M - CSF; (C) qRT - PCR a markerilor de diferențiere osteoblastică timpurie și tardivă osterix, Runx2, Col1a1, ALP, BSP și osteocalcină; (D) qRT - PCR a genei țintă Notch Hey1 și a markerului transgen EGFP. * p f/f .

Discuţie

În rezumat, raportăm un model de șoarece bitransgenic pentru osteoscleroză care este generat de expresia activată de cre recombinază a domeniului intracelular Notch1 (NICD) exclusiv în osteoblaste comise. Acești șoareci Notch GOF au dezvoltat osteoscleroză severă pe întregul schelet. Ștergerea genetică a Rbpj în mod specific la osteoblaste a abolit fenotipurile osteosclerotice și întârzierea creșterii. Mai mult, analizele celulare și moleculare ale oaselor de la șoarecii GOF: Rbpj f/f au confirmat că markerii de proliferare și diferențiere induși de NICD în osteoblaste au fost complet normalizați prin îndepărtarea Rbpj. Astfel, activarea căii canonice Notch în osteoblastele comise reprezintă un potențial mecanism patologic pentru dezvoltarea osteosclerozei. Mai mult decât atât, descoperirile noastre furnizează primele dovezi genetice din sistemul osos că activarea Notch în celulele diferențiate depinde exclusiv de calea sa canonică. Prin urmare, direcționarea selectivă a Rbpj poate fi o abordare terapeutică eficientă în bolile osoase în care există un câștig al funcției Notch, cum ar fi osteosarcomul.

Dezvăluiri

Toți autorii afirmă că nu au conflicte de interese.

Mulțumiri

Mulțumim lui G Karsenty (Universitatea Columbia) pentru șoarecii Cre Col1a1 2.3 - kb, D Melton (Universitatea Harvard) pentru șoarecii Rosa Notch și T Honjo (Universitatea Kyoto) pentru șoarecii Rbpj floxflox. Această lucrare a fost susținută de NIH Grants DE016990 (BL) și HD22657 (BL) și NIH Grant Grants T32> AI053831 (JT) și DK60445 (JT).