Paul Vigne

1 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Nisa, Franța,

2 Universitatea din Nisa Sophia Antipolis, Nisa, Franța,

Christian Frelin

1 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Nisa, Franța,

2 Universitatea din Nisa Sophia Antipolis, Nisa, Franța,

Conceput și proiectat experimentele: CF PV. Realizarea experimentelor: CF PV. Analiza datelor: CF PV. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: PV. A scris lucrarea: CF.

Abstract

Restricția alimentară este bine cunoscută pentru a crește durata de viață a unei varietăți de organisme de la drojdie la mamifere, dar relațiile dintre nutriție și toleranța hipoxică nu au fost încă luate în considerare. Hipoxia este o cauză majoră a morții celulare în infarctul miocardic și accidentul vascular cerebral. Aici am forțat moartea legată de hipoxie expunând Drosophila masculin de o zi la hipoxie cronică (5% O2) și am analizat supraviețuirea lor. Hipoxia cronică a redus durata medie de viață de la 33,6 zile la 6,3 zile când muștele erau hrănite cu o dietă bogată. O analiză demografică a indicat faptul că hipoxia cronică a crescut panta traiectoriei mortalității și nu riscul de deces pe termen scurt. Restricția alimentară produsă prin diluarea alimentelor, prin restricția drojdiei sau prin restricția aminoacizilor a inversat parțial acțiunea dăunătoare a hipoxiei. A crescut durata de viață a muștelor hipoxice până la șapte zile, ceea ce a reprezentat aproximativ 25% din durata de viață a unei muște hipoxice. Supraviețuirea maximă a muștelor hipoxice a necesitat doar zaharoză alimentară și a fost insensibilă la medicamente precum rapamicina și resveratrolul, care sporesc longevitatea animalelor normoxice. Rezultatele descoperă astfel o nouă legătură între nutriția proteinelor, semnalizarea nutrienților și rezistența la stresul hipoxic.

Introducere

Restricția dietetică (DR) crește durata de viață într-o varietate de organisme, cum ar fi drojdiile, nematodele, muștele fructelor și mamiferele [1] - [3]. La om, reduce incidența bolilor cronice legate de vârstă, cum ar fi diabetul, cancerul și bolile cardiovasculare [4]. Genele candidate care contribuie la longevitatea organismelor model au fost identificate folosind abordări genetice [5] - [11]. Produsele lor sunt implicate în semnalizarea insulinei, detectarea nutrienților și remodelarea cromozomilor. Încă nu este sigur dacă DR crește supraviețuirea prin același mecanism în diferite organisme sau după intervenții dietetice diferite [12], [13] și dacă mecanismele care operează în organisme model sunt relevante pentru situațiile patologice umane. Hipoxia, de exemplu, este o cauză majoră a morții celulelor cardiace și neuronale în infarctul miocardic și accidentul vascular cerebral. Impune condiții care sunt unice și, probabil, nu se găsesc în alte situații patologice, cum ar fi cancerele sau bolile neurodegenerative. Identificarea mecanismelor care contribuie la moartea celulelor hipoxice este un obiectiv major pentru dezvoltarea de noi strategii care ar încetini îmbătrânirea creierului și a inimii umane.

Drosophila este bine potrivită pentru a analiza influența nutriției asupra toleranței hipoxice (i) spre deosebire de drojdie sau C. elegans, dar asemănător oamenilor, muștele sunt aerobi obligați, (ii) pot fi crescute cohorte mari de muște pentru a analiza parametrii demografici [14], (iii) Drosophila tolerează expuneri mai lungi la condiții hipoxice decât majoritatea mamiferelor [15], [16], (iv) există o conservare strânsă a căilor de semnalizare hipoxică între muște și mamifere. Hipoxia stabilizează un factor de transcripție al familiei de bază helix-loop-helix (HIF-1 la mamifere, Sima la Drosophila). Sub tensiune normală a oxigenului, degradarea HIF-1/Sima este controlată de HIF prolil hidroxilazele, o familie de dioxigenaze dependente de 2-oxo-glutarat care hidroxilează reziduurile cheie de prolină în domeniul de degradare dependent de oxigen al HIF-1/Sima. Proteina von Hippel Lindau recunoaște proteinele HIF-1 hidroxilate și le vizează pentru degradarea proteazomală. În condiții hipoxice, activitatea prolil hidroxilazelor a scăzut, HIF-1/Sima nu mai este hidroxilat. Scapă de degradarea proteazomală, migrează către nucleu și interacționează cu elementele sensibile la hipoxie din regiunile de reglare ale genelor țintă [17], [18].

Aici am expus Drosophila masculin la hipoxie cronică (5% O2) și am analizat supraviețuirea acestora. Rezultatele au indicat faptul că supraviețuirea în condiții cronice hipoxice a fost puternic dependentă de condițiile alimentare. Toleranța maximă hipoxică a necesitat doar o sursă de carbohidrați alimentari și a fost compromisă de proteinele dietetice.

Rezultate si discutii

Am folosit Drosophila masculin din trei motive (i) țesuturile lor sunt compuse din celule postmitotice la fel ca inimile și creierele de mamifere, (ii) supraviețuirea lor este independentă de investiția energetică în producția de ouă și (iii) comportamentul lor de hrănire pare a fi independent de calitatea mâncării [13].

Influența hipoxiei cronice asupra supraviețuirii

Am expus muștele vechi de o zi la hipoxie cronică (5% O2) în prezența unui mediu bogat în nutrienți care conține 10% zaharoză și 10% drojdie inactivată la căldură (prescurtată ca „10S10Y”). Muștele hipoxice au păstrat o activitate aparent normală, dar supraviețuirea lor a fost scurtată (Fig. 1A). Hipoxia a scăzut durata medie de viață cu> 80% de la 33,6 zile la 6,3 zile. De asemenea, a scăzut durata medie de viață (de la 34,5 zile la 5,5 zile) și durata maximă de viață (de la 44,5 zile la 8,5 zile). Durata de viață redusă poate rezulta dintr-o creștere mai rapidă a ratei mortalității în funcție de vârstă (o creștere a pantei traiectoriei mortalității), dintr-un risc crescut de deces la toate vârstele (o schimbare în traiectoria mortalității) sau o combinație a celor două . Pentru a distinge între aceste posibilități am efectuat analize demografice detaliate. Figura 1B arată că mortalitatea specifică vârstei a muștelor normoxice și hipoxice a urmat traiectorii aproape liniare, așa cum se aștepta din modelul Gompertz. Hipoxia a crescut de 5 ori panta traiectoriei mortalității. O interpretare obișnuită este că tratamentul a crescut acumularea de daune ireversibile cu vârsta [14].

dietă

Muștele hrănite cu un regim 10S10Y au fost expuse la oxigenul atmosferic (21% O2) sau la hipoxie (5% O2) după cum s-a indicat.

(A) Analiza supraviețuirii.

Hipoxia a scăzut durata medie de viață de la 33,6 ± 0,8 zile (n = 79) la 6,3 ± 0,1 zile (n = 282).

(B) Mortalitate specifică vârstei.

Hipoxia a crescut de cinci ori panta reprezentării, sugerând o îmbătrânire accelerată.

O altă modalitate de accelerare a îmbătrânirii este creșterea temperaturii [14]. Prin urmare, am verificat dacă reducerea temperaturii a inversat efectul hipoxiei. Scăderea temperaturii de la 25 ° C la 18 ° C a scăzut activitatea muștelor și a crescut supraviețuirea lor prin scăderea pantei traiectoriei mortalității (neprezentată). Scăderea temperaturii a crescut durata medie de viață a muștelor în aceeași măsură în condiții normoxice (2,2 ori de la 33,6 zile la 75,7 ± 3,1 zile, n = 89) și hipoxice (2,2 ori de la 6,3 zile la 14,1 ± 0,4 zile, n = 194). Astfel, hipoxia și temperaturile crescute au avut acțiuni independente și aditive asupra longevității Drosophila.

Restricția dietetică a împiedicat moartea indusă de hipoxie

Restricția dietetică (DR) se aplică de obicei Drosophila prin diluarea simultană a zaharozei și drojdiei în mediul nutritiv. Figura 2 arată că supraviețuirea hipoxică a fost puternic dependentă de compoziția dietei. DR a influențat durata medie de viață (Fig. 2A), supraviețuirea pe termen scurt (Fig. 2B) și supraviețuirea maximă (Fig. 2C) în moduri similare. Dieta optimă a fost o dietă 3S3Y. A crescut durata de viață a muștelor hipoxice de 2,2 ori (13,7 ± 0,6 zile, n = 199) comparativ cu o condiție bogată 10S10Y (6,3 ± 0,1 zile, n = 282). Creșterea netă a duratei de viață (7,4 zile) a reprezentat 22% din durata medie de viață a muștelor normoxice menținute pe o dietă bogată, 10S10Y (33,6 zile).

Influența DR produsă prin diluarea alimentelor asupra supraviețuirii muștelor hipoxice .

(A) Durata medie de viață hipoxică.

Sunt afișate mijloacele ± sem.

(B) Supraviețuirea pe termen scurt măsurată după 10 zile de hipoxie cronică.

(D) Supraviețuire maximă.

Dimensiunile probelor au fost 1S1Y (89), 2S2Y (286), 3S3Y (199), 4S4Y (280), 5S5Y (342) și 10S10Y (282).

Fig. 3 prezintă curbe de supraviețuire selectate și traiectorii de mortalitate ale muștelor cu restricție alimentară și ale muștelor hipoxice. Traiectorii de mortalitate ale muștelor menținute pe diete 2S2Y, 3S3Y sau 4S4Y s-au deviat de la liniaritate. În primele 4 până la 6 zile de hipoxie, mortalitatea specifică vârstei a urmat aceeași traiectorie ca cea a muștelor hipoxice care au fost hrănite cu o dietă bogată 10S10Y. Apoi, traiectoria mortalității s-a uniformizat. O posibilă interpretare pentru aceste rezultate ar putea fi faptul că dieta a restricționat muștele adaptate la hipoxie prin încetinirea ratei lor de creștere a mortalității odată cu vârsta. DR are o acțiune diferită asupra muștelor normoxice. Reduce în totalitate mortalitatea ca urmare a unui risc mai redus de deces pe termen scurt [18].

(A) Analiza supraviețuirii duratei de viață a Drosophila pe diferite regimuri, după cum sa indicat.

Curbele de supraviețuire corespunzătoare dietelor 5S5Y și 10S10Y nu au fost statistic diferite, folosind testul log rank.

(B) Mortalitate specifică vârstei pentru muștele hipoxice expuse la diete 2S2Y, 3S3Y sau 4S4Y, după cum este indicat.

Restricția drojdiei a reprodus efectul benefic al DR

S-a raportat anterior că drojdia alimentară joacă un rol critic în răspunsurile DR și că supraviețuirea muștelor normoxice este în mare parte insensibilă la modificările zaharozei dietetice [19], [20]. În mod similar, restricția zaharozei dietetice în prezența a 10% drojdie a modificat cu greu supraviețuirea muștelor hipoxice (10S10Y: 6,3 ± 0,1 zile, n = 282, 10Y: 8,3 ± 0,1 zile, n = 128). În contrast, restricția de drojdie dietetică în prezența zaharozei 10% a crescut durata medie de viață de până la 2,5 ori (10S10Y: 6,3 ± 0,1 zile, n = 282, 10S: 15,7 ± 0,5 zile, n = 118). Influența drojdiei este analizată în continuare în Figura 4. Panoul A prezintă traiectoria mortalității muștelor hrănite cu o dietă de zaharoză de 10% în prezența diferitelor concentrații de drojdie. Drojdia a scăzut în mod clar panta traiectoriei mortalității într-un mod dependent de doză.

A. Traiectorii de mortalitate ale muștelor hipoxice crescute pe diete de zaharoză 10% suplimentate cu concentrații diferite de drojdie, așa cum este indicat.

Dimensiunile probelor au fost 10S1Y: 130, 10S2Y: 119, 10S4Y: 117, 10S5Y: 104, 10S10Y: 282.

B. Acțiuni comparate ale drojdiei dietetice asupra muștelor hipoxice și normoxice.

Muștele au fost crescute pe o dietă de zaharoză de 10% suplimentată cu concentrațiile indicate de drojdie în condiții normoxice (simboluri deschise) sau hipoxice (simboluri umplute) și s-au determinat supraviețuirile medii.

S.e.m au fost mai mici decât dimensiunile punctelor și nu sunt nici reprezentate

Muștele au fost crescute pe o dietă pură zaharoză (10S, n = 118), o dietă pură de drojdie (10Y, n = 128) sau pe o dietă 10% zaharoză și 10% cazeină (10S10C, n = 157), așa cum este indicat.

(A) analiza supraviețuirii.

(B) Mortalitate specifică vârstei.

De asemenea, este interesant de menționat că durata medie de viață a muștelor hipoxice pe o dietă fără zahăr și 10% zaharoză (15,7 ± 0,5 zile, n = 118) a fost mai mare decât cea observată în condiții optime de DR (3S3Y: 13,7 ± 0,6 zile, n = 199). Acest lucru a indicat faptul că o sursă de carbohidrați, cum ar fi zaharoza, a fost suficientă pentru a promova supraviețuirea hipoxică maximă și că drojdia alimentară a fost toxică pentru muștele hipoxice. Este important să subliniem că combinația dintre proteinele alimentare și hipoxia este toxică pentru muște. Drojdia sau cazeina dietetice sunt bine cunoscute pentru a crește durata de viață a muștelor normoxice [20] - [22]. Acest lucru este clar ilustrat în Figura 4B care compară influențele drojdiei dietetice asupra supraviețuirii muștelor normoxice și hipoxice. După cum a fost descris anterior de Min și Tatar [20], drojdia a produs o acțiune bifazică asupra supraviețuirii normoxice. Adăugarea de concentrații scăzute de drojdie a crescut supraviețuirea. Concentrațiile mai mari (> 5%) au scăzut-o. În condiții hipoxice, drojdia a scăzut doar supraviețuirea.

În cele din urmă, observația că răspunsurile DR au fost reproduse prin restricție de drojdie și nu prin restricție de zaharoză este un indiciu clar că efectul benefic al DR nu a fost legat de restricția calorică, așa cum sa observat anterior pentru muștele normoxice [19].

Aminoacizii dietetici reduc supraviețuirea hipoxică

Drojdia inactivată la căldură oferă o varietate de substanțe, inclusiv lipide și proteine. Prin urmare, pentru a evalua rolul proteinelor alimentare și al aminoacizilor asupra supraviețuirii hipoxice, am folosit un hidrolizat de cazeină în loc de drojdie. Durata de viață a muștelor hipoxice pe o dietă de 10% zaharoză și 10% cazeină (5,9 ± 0,2 zile, n = 157) a fost similară cu cea observată pe o dietă 10S10Y (6,3 ± 0,1 zile, n = 282). Curbele de supraviețuire și traiectoria mortalității au fost foarte similare (Figura 4). Astfel, o sursă de aminoacizi alimentari a reprodus toată acțiunea inhibitoare a drojdiei.

Dovezi recente sugerează că muștele femele sunt capabile să își schimbe comportamentul de hrănire ca răspuns la modificările dietei [23]. O posibilitate pentru rezultatele noastre ar putea fi aceea că proteinele dietetice au inhibat hrănirea și indus de condiții asemănătoare foamei. Această ipoteză a fost puțin probabilă din două motive (i) durata de viață a muștelor hipoxice hrănite cu o dietă bogată în proteine ​​(10S10Y: 6,3 ± 0,1 zile, n = 282) a fost mai mică decât cea a muștelor expuse la foamete completă (8,6 ± 0,3 zile, n = 100), sugerând că mor înainte de epuizarea rezervelor lor. (ii) Hrănirea muștelor masculine a fost raportată a fi independentă de dietă [13] și am verificat dacă muștele masculine hipoxice au ingerat alimente colorate atât în ​​prezența, cât și în absența proteinelor alimentare.

Dovezi farmacologice pentru o specificitate a răspunsurilor hipoxice DR

Mecanismele prin care DR extinde durata de viață a animalelor normoxice nu sunt încă pe deplin înțelese. Mai multe căi candidate contribuie la răspunsurile DR în Drosophila normoxică: Sir2 [5], semnalizarea insulinei [6], [7] și TOR, ținta rapamicinei [8]. Semnalizarea insulinei și TOR sunt strâns legate. De exemplu, foamea de aminoacizi activează calea TOR în corpul larvelor de grăsime și declanșează un semnal de foame care modulează semnalizarea insulinei în țesuturile periferice [24]. Participarea TOR la ​​răspunsul hipoxic DR a fost puțin probabil din două motive (i) semnalizarea TOR este inhibată la muștele hipoxice [25], (ii) rapamicina nu a favorizat supraviețuirea muștelor hipoxice hrănite cu o dietă 10S10Y sau 3S3Y (datele nu afișate). Alte dovezi farmacologice exclud, de asemenea, participarea sir2. Resveratrolul, un activator al sir2 care extinde durata de viață a muștelor normoxice [26], nu a crescut supraviețuirea muștelor hipoxice hrănite cu o dietă 10S10Y sau 1S1Y (datele nu sunt prezentate).

Concluzie

Rezultatele noastre descoperă o legătură nouă și nebănuită între nutriția proteinelor și toleranța hipoxică. Hipoxia cronică a scăzut durata de viață a Drosophila masculină și acest efect poate fi parțial inversat prin restricția aminoacizilor din dietă. Dovezi recente sugerează că DR îmbunătățește profilurile factorilor de risc pentru protecția împotriva bolilor cardiovasculare la om [4] și are atât acțiuni cardioprotectoare, cât și neuroprotectoare în modelele de rozătoare ale bolilor ischemice [27], [28]. Identificarea aminoacizilor din dietă și a semnalizării nutrienților ca factori majori care determină supraviețuirea hipoxică în modelul Drosophila sugerează posibilități noi de a dezvolta mimetici DR și de a reduce moartea celulelor hipoxice și consecințele acesteia la om.

Materiale și metode

Larvele tulpinii w 1118 au fost crescute pe o dietă standard (8,2% făină de porumb, 6,2% zaharoză, 1,7% drojdie și 1% agar suplimentat cu 3,75 g/l 4-hidroxibenzoat de metil). Bărbații adulți nou-născuți au fost colectați pe o perioadă de 24 de ore, împărțiți în loturi de 10 muște pe flacon și expuși la diferite diete. Mediul nutritiv a constat din zaharoză, pulbere de drojdie inactivată la căldură, 2% agar și 3,75 g/l 4-hidroxibenzoat de metil. Un mediu nutritiv „10S10Y” înseamnă un mediu nutritiv de 10% S ucroză și 10% Y est. În unele experimente, un hidrolizat de cazeină a fost utilizat ca sursă de aminoacizi. Flacoanele au fost sigilate cu septuri de cauciuc (SubA Seal, ID 22 mm, Sigma, St Louis, Mo). Au fost fulgerate cu 20 de volume dintr-o atmosferă premixată 5% O2/95% N2 și folosind două ace 18G. Muștele au fost menținute la 25 ° C sub un ciclu de lumină/întuneric de 12 h/12 h și au obținut un scor de supraviețuire de două ori pe zi. Muștele moarte au fost diagnosticate de lipsa lor de răspuns la ședință.

În experimentele folosind instrumente farmacologice, 250 de soluții de resveratrol 100 uM în soluție salină tamponată cu fosfat sau de 50 uM rapamicină în etanol diluat au fost stratificate pe partea superioară a mediului nutritiv și au fost lăsate să se adsorbe peste noapte. Am verificat dacă vehiculul nu a modificat durata de viață a muștelor hipoxice.

Supraviețuirea medie ± sem este indicată. Supraviețuirea maximă a fost calculată calculând durata medie de viață a ultimului 10% supraviețuitor. Datele au fost analizate folosind software-ul GraphPad prism 4.

Note de subsol

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de Institutul Național al Sănătății și al Cercetării Medicale, Fédération pour la Recherche sur le Cerveau și Universitatea din Nisa Sophia Antipolis.