Abstract

Introducere

Incidența diabetului de tip 2 crește rapid la nivel mondial, în special la persoanele cu descendență din Asia de Sud (SA) (1). SA provin din subcontinentul indian și reprezintă o cincime din populația lumii. Atât AS native, cât și cele migrante prezintă un risc ridicat de a dezvolta diabet de tip 2, comparativ cu caucazienii (Cs) (2-4). Prevalența diabetului de tip 2 nu este doar de patru până la șase ori mai mare, dar apare și la o vârstă mai mică și cu un IMC mai mic (4-6). Mai mult, riscul de complicații cardiovasculare și renale este mai mare (7-10). Cauza fundamentală a acestui risc în exces este încă incomplet înțeleasă și doar câteva studii aprofundate au fost efectuate pentru a investiga patogeneza diabetului de tip 2 în SA (11,12).

calorii

Observația că SA are un conținut ridicat de lipide hepatice și intramiocelulare în comparație cu persoanele cu descendență C (13,14) ar putea sugera că SA au o β-oxidare a acidului gras mitocondrial (FA) afectată fie în mușchiul scheletic și/sau în țesutul adipos, rezultând depunerea de grăsime ectopică în țesuturile periferice, ducând în cele din urmă la rezistența la insulină (IR) și alte disfuncții metabolice (15). Prin urmare, AS pot fi mai puțin capabile să facă față dietei bogate în grăsimi (HF) de tip occidental în comparație cu Cs.

Interesante în acest context sunt descoperirile recente cu privire la calea rapamicinei (mTOR) a mamiferelor care conțin nutrienți și energie. Calea mTOR reglează creșterea celulară în funcție de starea energiei celulare și disponibilitatea nutrienților (16). Complexul mTOR activat 1 (mTORC1) controlează procesele celulare cheie [de exemplu, inhibă semnalizarea insulinei (17) și joacă un rol crucial în reglarea metabolismului oxidativ și a biogenezei mitocondriale (18-21)]. Important, mTORC1 pare, de asemenea, să promoveze sinteza și stocarea lipidelor, inhibând în același timp procesele care duc la consumul de lipide (22). Într-adevăr, există dovezi în creștere că mTORC1 suprimă FA β-oxidarea (21,23,24). Prin urmare, presupunem că diferențele în activitatea mTOR între cele două etnii pot sta la baza sau pot contribui la creșterea riscului de diabet de tip 2 în AS.

Scopul acestui studiu a fost de a investiga dacă adaptarea metabolică la o dietă de 5 zile cu HF, bogată în calorii (HFHC) este diferită între bărbații tineri, sănătoși slabi SA și Cs potrivite. În special, ne-a interesat dacă există diferențe în activitatea mTOR în mușchiul scheletic între cele două etnii, atât la momentul inițial, cât și ca răspuns la dieta HFHC. Mai mult, au fost evaluate sensibilitatea la insulină hepatică și periferică, oxidarea substratului, distribuția grăsimii abdominale, semnalizarea insulinei mușchilor scheletici și conținutul lanțului respirator mitocondrial.

Proiectare și metode de cercetare

Subiecte

Doisprezece SA olandeze și 12 C olandezi, slabi (IMC 2) și bărbați sănătoși, cu vârsta cuprinsă între 19 și 25 de ani, cu antecedente familiale pozitive de diabet de tip 2, au fost înscriși prin reclame locale. Subiecții au fost supuși unui screening medical, incluzând istoricul lor medical, un examen fizic, teste de chimie a sângelui și un test de toleranță orală la glucoză pentru a exclude persoanele cu diabet de tip 2, conform criteriilor Asociației Americane a Diabetului din 2010. Alte criterii de excludere au fost exercițiile fizice riguroase, fumatul și schimbarea recentă a greutății corporale. Studiul a fost aprobat de Comitetul etic medical al Centrului Medical al Universității Leiden și realizat în conformitate cu principiile Declarației revizuite de la Helsinki. Toți voluntarii au dat consimțământul scris în scris înainte de participare.

Design de studiu

Subiecții au fost studiați înainte și după o dietă HFHC de 5 zile, constând din dieta obișnuită a subiectului suplimentată cu 375 ml de cremă pe zi (1.275 kcal/zi, 94% grăsime). La sfârșitul primei zile de studiu, subiecții au primit 15 căni de 125 ml de smântână. Ei au fost instruiți să-și continue dieta obișnuită și, pe deasupra, să consume trei căni de smântână pe zi direct după o masă, pentru a se asigura că pot respecta obiceiurile lor alimentare obișnuite. În plus, au ținut un jurnal alimentar înainte și în timpul dietei HFHC pentru a estima aportul dietetic normal, pentru a maximiza respectarea dietei și pentru a verifica conformitatea și comportamentul de compensare. Jurnalele au fost introduse și analizate folosind o aplicație specializată de Internet (http://www.dieetinzicht.nl, în olandeză). Conformitatea a fost măsurată solicitând subiecților să aducă cești rămase, întrebând, analizând jurnalele alimentare și parametrii de laborator. Subiecții au fost instruiți să nu modifice obiceiurile de viață și să nu efectueze activitate fizică în ultimele 48 de ore înainte de zilele de studiu. Studiile de rezonanță magnetică (RM) au fost efectuate cu puțin timp înainte și în a cincea zi a dietei HFHC. Studiile metabolice au fost efectuate cu 1 zi înainte și 1 zi după dietă.

Studii MR

Depozitele de grăsime abdominală au fost cuantificate cu imagistica RM cu turbo spin-echo utilizând un scaner MR de 1,5 Tesla pentru tot corpul (Gyroscan ACS-NT15; Philips, Best, Olanda) la 4 ore după ultima masă (25). În timpul unei rețineri a respirației, s-au obținut trei imagini transversale la nivelul L5. Volumele depozitelor de grăsime viscerală și subcutanată au fost cuantificate utilizând software-ul analitic MASS (Medis, Leiden, Olanda). Numărul de pixeli a fost convertit în centimetri pătrat și înmulțit cu grosimea feliei (10 mm). Conținutul de trigliceride hepatice (HTG) a fost evaluat prin spectroscopie MR cu protoni (26). S-a obținut un spectru fără suprimarea apei, patru medii, ca standard intern, și 64 medii au fost colectate cu suprimarea apei. Spectrele au fost montate utilizând software-ul de interfață utilizator MR bazat pe Java (versiunea jMRUI 2.2) (26). Procentul semnalelor trigliceridelor hepatice a fost calculat ca: (amplitudine semnal trigliceride hepatice/amplitudine semnal apă) × 100.

Studii metabolice

Măsurătorile antropometrice, o clemă hiperinsulinemică-euglicemică în doi pași cu izotopi stabili și calorimetria indirectă au fost efectuate după un post peste noapte. În plus, s-au obținut biopsii ale mușchilor scheletici. Grăsimea și masa corporală slabă (LBM) au fost evaluate prin analiza impedanței bioelectrice (Bodystat 1500; Bodystat Ltd., Douglas, Marea Britanie).

Clemă hiperinsulinemică-euglicemică

O clemă hiperinsulinemică-euglicemică în 6 etape în 2 h a fost realizată așa cum s-a descris anterior (27). Pe scurt, s-a folosit o perfuzie constantă amorsată de trasor de glucoză ([6,6-2 H2] -glucoză; 0,22 μmol/kg/min) pentru a determina ratele de apariție a glucozei (Ra) și eliminarea glucozei (Rd). La momentul (t) = 120 min (pasul 1) și t = 240 min (pasul 2), o perfuzie constantă amorsată de insulină (pasul 1: 10 mU/m 2/min; pasul 2: 40 mU/m 2/min ) a fost început și glucoza 20% îmbogățită cu 3% [6,6-2 H2] -glucoză a fost perfuzată cu o rată variabilă pentru a menține nivelul glucozei la 5,0 mmol/L. În stare bazală (t = 0 min), la sfârșitul perioadei noninsulin-stimulate (t = 95-115 min) și la sfârșitul fiecărei etape (t = 210-240 min și t = 330-360 min), au fost prelevate probe de sânge pentru determinarea glucozei, insulinei, C-peptidei, FA libere (FFA) și [6,6-2 H2] -glucoză - activitate specifică.

Calorimetrie indirectă

Calorimetria indirectă a fost efectuată cu o hota ventilată (Oxycon Pro; CareFusion, Höchberg, Germania) în stare bazală și în ambele etape ale clemei.

Biopsii musculare scheletice

Biopsiile musculare din vastul lateral lateral ((75–100 mg) au fost colectate în condiții bazale și hiperinsulinemice (la 30 de minute din etapa 2) sub anestezie localizată folosind un ac Bergström modificat (28). Probele de mușchi au fost împărțite în două părți, congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la o analiză ulterioară.

Calcule

Glucoza Ra și Rd au fost calculate ca viteza de perfuzie a trasorului împărțită la raportul trasor-la-tras (29). Producția endogenă de glucoză (EGP) a fost calculată ca diferență între ratele de Ra și perfuzia de glucoză. Rd și EGP au fost ajustate pentru kilogramele de LBM. Rata de eliminare metabolică a insulinei (MCRi) a fost calculată în conformitate cu Elahi și colab. (30). Cheltuielile de energie de repaus (REE), coeficientul respirator (RQ) și ratele de oxidare a substratului au fost determinate așa cum au fost descrise de Simonson și DeFronzo (31). Eliminarea glucozei oxidative (NOGD) a fost calculată prin scăderea ratei de oxidare a glucozei din Rd. Indicele IR hepatic (HIR) a fost calculat ca produs al EGP stimulat de noninsulină și al concentrației serice de insulină în repaus alimentar (32). Rata de eliminare metabolică a glucozei (MCRg) a fost calculată ca rata de dispariție a glucozei (Rd) împărțită la concentrația serică de glucoză (media măsurătorilor la starea de echilibru) (33).

Analiza de laborator

Glucoza și trigliceridele serice de post au fost măsurate pe un analizor Modular P800 (Roche, Mannheim, Germania); insulină serică și niveluri de peptide C pe un Immulite 2500 (Siemens, Breda, Olanda); HbA1c pe o mașină de cromatografie lichidă de înaltă performanță, Primus Ultra 2 (Kordia, Leiden, Olanda); iar FFA-urile plasmatice au fost determinate printr-o metodă colorimetrică (Wako Chemicals, Neuss, Germania). Nivelurile de glucoză din sângele integral arterializate în timpul clemei au fost măsurate prin tehnica glucozei dehidrogenază-NAD (Precision Xtra Blood Glucose Monitoring System; Abbott SUA, Abbott Park, IL). [6,6-2 H2] -Îmbogățirea cu glucoză a fost măsurată într-o singură analiză folosind cromatografia gazoasă-spectrometrie de masă așa cum s-a descris anterior (34).

Izolarea ADN/ARN și PCR în timp real

ARN-ul total a fost izolat din biopsiile mușchilor scheletici (~ 25-30 mg) folosind metoda de extracție a fenol-cloroformului (reactiv Tripure RNA Isolation; Roche), tratată cu un kit DNAse conform instrucțiunilor producătorului (TURBO DNAse, Life Technologies, Bleiswijk, Olanda), și cuantificat de NanoDrop. CADN-urile din prima catenă au fost sintetizate dintr-un ARN total de 1 μg folosind un kit de sinteză pentru prima catenă Superscript (Invitrogen, Bleiswijk, Olanda). Testele PCR în timp real au fost efectuate folosind seturi de grunduri specifice (secvențe furnizate la cerere) și SYBR Green pe un sistem StepOne Plus Real-Time PCR (Applied Biosystems). Expresia ARNm a fost normalizată la proteina ribozomală S18 și exprimată ca unități arbitrare. ADN-ul genomic a fost extras folosind trusa Qiagen pentru țesut și sânge (Qiagen, Mainz, Germania), iar concentrațiile au fost măsurate spectrofotometric (GeneQuant; GE Healthcare, Freiburg, Germania). Numerele copiilor de ADN mitocondrial (ADNmt) și ADN nuclear (ADNm) au fost cuantificate așa cum s-a descris anterior (35), iar raportul mtADN-ADNn a fost utilizat ca indice de densitate mitocondrială. O prezentare completă a tuturor genelor analizate poate fi găsită în Tabelul 1 suplimentar.

Western Blot

Biopsiile musculaturii scheletice (∼30-45 mg) au fost omogenizate de Ultra-Turrax (22.000 rpm; 2 × 5 s) într-un raport 6: 1 (vol/greutate) de tampon rece cu gheață conținând: 50 mmol HEPES (pH 7,6), 50 mmol NaF, 50 mmol KCl, 5 mmol NaPPi, 1 mmol EDTA, 1 mmol EGTA, 5 mmol β-GP, 1 mmol Na3VO4, 1 mM ditiotreitol, 1% Nonidet P-40 și inhibitori de protează cocktail (complet; Roche ). Western blots au fost efectuate utilizând fosfo-specific (Ser473-protein kinază B [PKB], substrat fosfo-Akt, Ser2448-mTOR și Thr389- proteină ribozomală S6 kinază β1 [S6K] de la Cell Signaling Technology; Thr246 - substrat Akt bogat în prolină de 40 kDa [PRAS40] de la BioSource International) sau anticorpi primari totali (Tubulin, Akt1 + 2, substrat Akt de 160 kDa; mTOR și S6K de la Cell Signaling Technology; PRAS40 de la BioSource International; MitoProfile OXPHOS de la Abcam; izoforma receptorului de insulină β [ IRβ] de la Santa Cruz Biotechnology) (36). Bloturile au fost cuantificate prin analiză densitometrică utilizând software-ul ImageJ (National Institutes of Health).

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM atunci când sunt distribuite în mod normal sau ca mediană (interval interquartiliu [IQR]) când nu sunt distribuite în mod normal. A fost aplicat un model cu efecte mixte pentru a evalua diferențele medii înainte și după intervenția în cadrul și între grupuri și pentru a determina diferențele în efectul dietei. Grupurile și intervenția au fost modelate ca efecte fixe, iar abaterile specifice subiectului din media grupului au fost modelate ca efecte aleatorii. Au fost efectuate teste nonparametrice (testul de rang semnat de Wilcoxon în cadrul grupului și Mann-Whitney între grupuri) atunci când a fost cazul. Nivelul de semnificație a fost stabilit la P 2; P = 0,11), dar subiecții cu SA au fost semnificativ mai scurți și mai ușori (Tabelul 1). Procentul de masă grasă a fost semnificativ mai mare în SA în ambele zile de studiu și, în consecință, procentul de LBM a fost mai mic. Circumferința taliei nu a diferit între grupuri. Nivelurile de glucoză și insulină la jeun au fost similare la momentul inițial, dar au fost semnificativ mai mari în SA după dieta HFHC. Nivelurile de peptidă C de post au crescut semnificativ într-un grad similar în ambele grupuri. HbA1c a fost mai mare în AS, la fel ca și colesterolul LDL (2,77 [1,69] față de 1,84 [0,91] mmol/L; P = 0,03).

Caracteristicile clinice, compoziția corpului și nivelurile plasmatice și serice de post înainte și după o dietă HFHC de 5 zile la bărbați tineri din Asia de Sud sănătoși și caucazieni asortați

Dieta și exercițiile fizice

Nivelul de activitate fizică a fost comparabil între ambele etnii (Tabelul suplimentar 2). Dieta SA a constat în mai puține calorii pe zi (SA: 2.170 ± 102 vs. C: 2.593 ± 100 kcal; P = 0.008), dar corectată pentru greutatea corporală, cantitatea de calorii a fost similară (SA: 34 ± 2 vs. C: 35 ± 1 kcal/zi/kg; P = 0,91). Ambele etnii au consumat același procent de grăsimi (~ 30%), carbohidrați (~ 50%) și proteine ​​(~ 16%). Ambele grupuri au respectat bine dieta. Aportul mediu zilnic de calorii a fost de ~ 55% mai mare comparativ cu dieta lor normală, iar ~ 54% din energie a fost derivată din grăsimi (Tabelul suplimentar 2).

Distribuția grăsimilor

Nu s-au găsit diferențe între grupuri pentru volumele de grăsime viscerală și subcutanată atât la momentul inițial, cât și după dieta HFHC. Mai mult, nu s-a observat niciun efect dietetic. HTG a crescut semnificativ după dieta în ambele grupuri, dar nu au fost observate diferențe între grupuri (Tabelul 1).

Producția endogenă de glucoză și Rd

Parametrii metabolici ai unei cleme hiperinsulinemice-euglicemice în doi pași cu izotopi stabili înainte și după o dietă HFHC de 5 zile la bărbați tineri din Asia de Sud sănătoși și caucazieni asortați

Ratele de oxidare a glucozei și lipidelor

REE, corectat pentru LBM, RQ, ratele de oxidare a substratului și NOGD în condiții bazale și etapa 1 a clemei au fost comparabile pentru ambele grupuri înainte și după dieta HFHC (Tabelul 3). Cu toate acestea, în etapa 2, oxidarea glucozei a crescut semnificativ în SA, în timp ce nu a fost observat niciun efect dietetic în Cs. În mod interesant, NOGD în pasul 2 a fost semnificativ mai mare în SA comparativ cu Cs la momentul inițial (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

Parametri pentru calorimetria indirectă înainte și după o dietă HFHC de 5 zile la bărbați tineri din Asia de Sud sănătoși și caucazieni asortați

Semnalizarea musculaturii scheletice

Exprimarea proteinelor și starea de fosforilare a moleculelor cheie implicate în insulină și căile de semnalizare mTOR au fost determinate în stare bazală și în timpul clemei hiperinsulinemico-euglicemice din mușchiul scheletic (Fig. 1). O tendință pentru o expresie IRβ redusă a fost observată în SA. În timpul hiperinsulinemiei, starea de fosforilare a proteinelor cheie implicate în calea insulină/mTOR (PKB, substrat Akt de 160 kDa [AS160], PRAS40, mTOR și S6K1) a fost semnificativ crescută în comparație cu cea bazală, așa cum era de așteptat (Fig. 1) . Nu s-au observat diferențe evidente între grupuri, indiferent de condiții.