Contribuit de Hans Kornberg, 25 octombrie 2006 (primit pentru revizuire 17 octombrie 2006)

pentru

Abstract

Fructoza poate fi preluată de Escherichia coli printr-o varietate de proteine ​​care acoperă membrana și recunosc zaharurile cu configurația 3,4,5-d-arabino-hexoză. Aici, descriem un mutant lipsit de aceste proteine, dar care preia fructoză prin intermediul purtătorului FucP utilizat în mod normal pentru transportul α-l -fucozei; aceasta implică faptul că fructoza este preluată sub forma α- sau β-fructopiranoză. Pentru creștere, fructoza asimilată este fosforilată secvențial de ATP și (i) manno (fructo) kinază, pentru a forma fructoză 6-fosfat și (ii) fosfofructokinază, pentru a forma fructoză 1,6-bisfosfat, care este un membru al căilor centrale de glicoliză și gluconeogeneză. Mutația care conferă organismului capacitatea de a prelua fructoză prin regulamentul fucozei a fost localizată ca o deleție a genei fucA cu inducerea consecventă a transportorului de fucoză legat de protoni, FucP.

Am descris anterior (1) proprietățile unui mutant de Escherichia coli desemnat HK 2148 care este capabil să crească pe fructoză ca singură sursă de carbon, în ciuda inactivării tuturor căilor cunoscute care implică sistemul fosfoenolpiruvat/glicoză fosfotranferază (PT) pentru absorbția și utilizarea acestei cetoză (2). Intrarea fructozei în această tulpină se realizează prin difuzarea facilitată a acesteia printr-o izoformă a transportorului de glucoză normal legat de PT, PtsG, care necesită, prin urmare, să se asigure concentrații relativ mari de fructoză în mediu (Km pentru creștere = ≈8 mM) . Așa cum ar fi de așteptat din acest mod de absorbție a fructozei, creșterea pe acest substrat este puternic inhibată de analogii glucozei, cum ar fi metil-α-d-glucozidă (αMG). Cu toate acestea, culturile de HK 2148 expuse timp de câteva zile la 37 ° până la 20 mM fructoză plus 1 mM αMG au dat naștere la mutanți suplimentari, dintre care unii nu au fost doar impermeabili la prezența αMG atunci când au crescut pe fructoză, dar au crescut pe această cetoză la concentrații mult mai mic (Km pentru creștere 14 C) Fructoză de HK 2298.

În timp ce suspensiile de HK 2298 cultivate cu LB au preluat cu ușurință și au încorporat 14 C din [14 C] fructoză la concentrații de până la 0,1 mM, suspensii similare de HK 2148 au făcut acest lucru doar într-o măsură neglijabilă (datele nu sunt prezentate). Nici PtsG, nici proteinele specificate de operonul fructozei legate de PT nu au fost implicate în această absorbție: un derivat al HK 2298 care transporta și ptsG: kanR (tulpina HK 2385) a crescut pe fructoză și a preluat această cetoză la rate care nu se disting de HK 2298, la fel ca și alți derivați ai HK 2298 care poartă fie fruA: kanR (tulpina HK 2578), fie o deleție care acoperă regiunea promotoră a operonului fructozei, precum și fruB și fruK (tulpina HK 2544).

Localizarea genului responsabil pentru captarea fructozei.

Pentru a evita posibilele erori datorate introducerii operonului de fructoză legat de PT, un număr de tulpini Hfr de E. coli care transferă ADN din diferite puncte de origine și în direcții diferite și care transportă transpozonul Tn10 în siturile cunoscute (3) au fost încrucișate cu tulpina HK 2578, un derivat al HK 2298 în care activitatea FruA a fost ștearsă prin introducerea fruA: kanR; toți exconjuganții au fost testați pentru reținerea markerului kanR. Aceste colonii rezistente la tetraciclină au fost examinate pentru pierderea capacității lor de a crește pe fructoză 2,5 mM. Am constatat că tulpina Hfr BW6169, care poartă argA: Tn10 situată la minutul 63.5 pe harta de legătură E. coli (4) și își transferă ADN-ul în sens invers acelor de ceasornic de la aproximativ minutul 84.8, a dat naștere coloniilor rezistente la tetraciclină, dintre care 40% nu a reușit să crească pe fructoză și care a luat, de asemenea, 0,5 mM [14 C] fructoză la o rată neglijabilă. Acest rezultat a plasat sistemul presupus de captare a fructozei într-un loc apropiat de argA. Această locație (5) a fost definită mai precis prin transducția HK 2578 cu fagii care transportă fucP: Tn10, o ștergere a genei care specifică transportul de fucoză legat de protoni, care este situat la min 63.2. Niciunul dintre cei 116 transductanți obținuți nu a crescut sau a preluat fructoză.

Identitatea sistemului de absorbție a fructozei cu o componentă a regulii fucozei (6) a fost investigată cu doi transductanți argA: Tn10 din cruce [fagul P1 crescut pe BW6169 × HK 2578], unul (HK 2621) care și-a păstrat capacitatea de a cresc pe fructoză și cealaltă (HK 2622) fiind printre cei 40% care o pierduseră. Am observat că absorbția de 0,5 mM [14 C] fructoză de HK 2621 crescut cu LB a fost puternic inhibată de 0,1 mM-α- l - (-) - fucoză, dar nu de d - (+) - fucoză (Fig. 1A) . HK 2622 a preluat fructoza marcată la l - (-) - fucoză (Fig. 1B).

Efectul α-l-glucozei asupra absorbției de 0,5 mM [14 C] fructoză. (A) Tulpina HK 2621 (Fuc-F +) care ia [14 C] fructoză singură (○) și în prezența d - (+) - fucozei (▴) sau a l - (-) - fucozei (●) . (B) Tulpina HK 2622 (Fuc-F -) luând [14 C] fructoză singură (○) și în prezența l - (-) - fucoză (●). Notă diferența de scară.

Mai mult, suspensiile de HK 2621 crescute cu LB au preluat într-o măsură semnificativă α- l - [3 H] fucoză, în timp ce suspensiile similare de HK 2622 nu (Fig. 2).

Preluarea de 0,5 mM [3 H] fucoză prin tulpina HK 2621 (Fuc-F +) (○) și prin tulpina HK 2622 (Fuc-F -) (■).

Această absorbție de către HK 2621 (și de către părintele său, HK 2578) s-a produs rapid în primele câteva minute de expunere la izotop și apoi a crescut doar într-o mică măsură, ceea ce a indicat că fucoza preluată nu a mai fost metabolizată în continuare. În acord cu această interpretare, am observat că nici o tulpină, HK 2578 și HK 2621, nu a crescut pe α-l-glucoză, în timp ce părinții lor cu fructoză negativă HK 2148 și HK 2632 nu au crescut. Mai mult, în plus față de 1 mM-α- l -fucoză la culturile de HK 2578, creșterea pe 1-10 mM fructoză a împiedicat în mare măsură creșterea, cu cinetica care indică inhibarea competitivă (Fig. 3); întrucât adăugarea de α-l-glucoză la culturile de HK 2632 crescând pe 5-20 mM fructoză nu a avut un astfel de efect (datele nu sunt prezentate).

Grafic Hanes al efectului 1 mM-α-l -fucozei asupra creșterii tulpinii HK 2578 (Fuc-F +) la diferite concentrații de fructoză ((). Ratele de creștere în absența a-l -fucozei sunt prezentate ca ●.

Aceste observații au sugerat că abilitatea de a prelua și de a crește fructoza prin regulamentul fucozei a fost asociată cu o mutație la un membru al regulonului respectiv. Acest lucru a fost confirmat prin compararea secvențelor de ADN ale genelor sale componente fucP, fucK și fucA, prezente în tulpinile fructo-pozitive (Fuc-F +) HK 2578 și HK 2621 și omologii lor fructo-negativi HK 2148 și HK 2622. Am constatat că secvențele ADN ale fucP și fucK erau identice și corespundeau exact secvențelor publicate pentru aceste gene (7), dar că regiunea fucA din HK 2148 și HK 2622 diferea semnificativ de cea prezentă în HK 2578 și HK 2621. ADN-ul secvența fucA din tulpinile HK 2148 și 2622 a corespuns din nou cu secvența publicată, dar produsul PCR din această regiune în HK 2578 și HK 2621 a fost clar mai mic (Fig. 4); mai mult, primerii care obținuseră produse excelente de PCR și secvențe de ADN reproductibile în tulpinile Fuc-F - nu au reușit să facă acest lucru în toate tulpinile care manifestă fenotipul Fuc-F +.

Produse PCR din regiunile fucA din HK 2622 și HK 2621.

Metabolismul fructozei preluat.

Dacă fructoza este preluată printr-un purtător de fucoză dereprimată, aceasta va intra în celule nemodificate chimic și ar fi de așteptat să fie supusă fosforilării la fructoză 6-fosfat în prezența ATP și a manno (fructo) kinazei (Mak) (1); 6-fosfatul de fructoză astfel format ar fi apoi fosforilat în continuare de ATP în prezența fosfofructokinazei (PfkA). Două strategii au fost folosite pentru a testa această ipoteză.

În prima, genele care specifică Mak + și PfkA + în HK 2298 au fost înlocuite selectiv cu omologii lor negativi. Astfel, HK 2298 a fost infectat cu fagul P1 crescut pe tulpina HK 2198, care poartă mak-o cotransducibil cu argJ: Tn10 (8); > 70% din transductanții rezistenți la tetraciclină nu au crescut pe fructoză. O eliminare similară a capacității de a crește pe fructoză a fost observată atunci când HK 2298 (care poartă argHBCE, situat la min 89,5) a fost infectat cu fagul P1 crescut pe o tulpină care a fost ArgHBCE + și a purtat, de asemenea, pfkA (situat la min 88,5). Transductanții au fost selectați pe plăci care conțin glicerol ca sursă de carbon, dar care nu conțin arginină; toți cei care nu au mai crescut pe glucoză și, prin urmare, au fost PfkA - de asemenea nu au reușit să crească pe fructoză.

O a doua strategie de testare a rutei postulate pentru utilizarea fructozei a constat în introducerea secvențială a genelor pentru Mak + și sistemul de transport al fructozei legat de fucoză Fuc-F + într-o tulpină primitoare lipsită de amândouă. HK 2140 are aceste proprietăți (1). Într-o abordare, a fost încrucișată cu fag crescut pe tulpina Fuc-F + HK 2621 care a purtat și argA: Tn10: Niciunul dintre transductanții rezistenți la tetraciclină nu a crescut pe fructoză 2,5 mM. Deoarece nu a fost fezabil să se stabilească care dintre numeroasele colonii transduse au primit gena care specifică Fuc-F +, un număr a fost combinat și infectat cu fag crescut pe tulpina Mak + HK 2193 care a purtat, de asemenea, argJ: kanR cotransducibil cu mak. Aproximativ 40% din transductanții rezistenți la kanamicină au crescut pe fructoză.

În secvența inversă, fagii crescuți pe tulpina Mak + kanR 2193 au fost încrucișați cu HK 2140: Din nou, niciunul dintre transductanții rezistenți la kanamicină nu a crescut cu 2,5 mM-fructoză, dar când o colonie care a crescut cu 20 mM-fructoză (și a avut prin urmare Mak + achiziționat a fost infectat cu fag crescut pe tulpina Fuc-F + argA: Tn10 HK 2621, ~ 40% din transductanții rezistenți la tetraciclină au crescut pe fructoză 2,5 mM.

Discuţie

Am rezumat anterior dovezile că fructoza poate pătrunde în E. coli printr-o serie de proteine ​​care se întind pe membrană, toate recunoscând configurația 3,4,5-d-arabino-hexoză a d-fructozei, d-glucozei, d - manoză, d-manitol și d-glucitol (2). Prin urmare, a fost neașteptat faptul că la un mutant lipsit de toți acești purtători, o altă mutație în regulonul fucozei ar putea efectua în mod eficient absorbția fructozei. Cu toate acestea, deși α- l -fucoza care s-a arătat în prezenta lucrare pentru a concura cu intrarea fructozei nu are configurația 3,4,5-d-arabino-hexoză, este asemănătoare izbitor cu forma piranozei de α- sau β-d-fructoză (Schema 1)

De asemenea, s-a stabilit (9) că într-o soluție apoasă, 57% din fructoză este sub forma β-d-piranoză. Prin urmare, este probabil că această formă pătrunde în celule prin intermediul componentei FucA a regulonului fucozei și că mutația relevantă a HK 2148 care a dat naștere HK 2298 a dus la derepresia genei fucP +. Acest lucru ar fi în concordanță cu punctul de vedere (6) că genele sistemului fucozei funcționează ca un regulon conținând cel puțin trei operoni, dintre care fucP și fucA formează părți separate și că substratul pe care acționează FucA, fuculoza 1-fosfat, se știe că induce transportorul de fucoză: Ștergerea fucA + ar determina acumularea de fuculoză 1-fosfat. Acest lucru ar fi, de asemenea, analog cu observațiile că creșterea fructozei prin proteinele care specifică absorbția manozei, glucitolului și manitolului este efectuată prin derepresia genelor corespunzătoare (2).

Demonstrația noastră actuală că atât Mak + cât și PfkA + sunt necesare pentru creșterea HK ​​2298 și a derivaților săi susține concluzia că fructoza preluată de sistemul Fuc-F + urmează ulterior calea

Materiale și metode

Tulpini și condiții de creștere.

Tulpinile bacteriene utilizate sunt enumerate în Tabelul 1. Bacteriile au fost cultivate la 37 ° C fie într-o cultură lichidă constând din bulion LB (25 g de bază LB pe litru de apă), fie în mediu definit (10), fie pe un astfel de mediu solidificat cu 2% agar. Densitatea celulară a fost măsurată în cuve de 1 ml (traiectorie de lumină de 1 cm) cu absorbanță la 600 nm (A600 de 1,0 fiind echivalent cu 0,26 mg de masă uscată per mililitru). Procedurile utilizate pentru conjugările mediate prin recombinare de înaltă frecvență și pentru transducțiile mediate de fagul P1 au fost cele descrise de Miller (11).

Tulpini bacteriene utilizate în acest studiu

Captarea substraturilor etichetate.

Absorbția de 0,5 mM [14 C] fructoză sau 0,5 mM [3 H] fucoză a fost măsurată ca cantități de material radioactiv reținut de celule la 0,2 mg de masă uscată pe milimetru, agitat în vase de mică adâncime într-o baie de apă la 30 ° C . Probele (0,1 ml) au fost prelevate la momente cunoscute, filtrate rapid prin filtrele Millipore (Billerica, MA) (dimensiunea porilor, 0,45 nm) și spălate cu 2 × 5 ml tampon fosfat 50 mM, pH 7. Filtrele au fost introduse imediat în cuve de plastic conținând 5 ml Ecoscint H (National Diagnostics, Atlanta, GA), iar radioactivitatea lor a fost testată cu un contor de scintilație LS 6500 MultiPurpose (Beckman Coulter, Fullerton, CA). [14 C] Fructoza și [3 H] fucoza au fost obținute de la produse chimice radiomarcate americane (St. Louis, MO).

Analiza ADN-ului genomic.

Procedurile pentru amplificarea ADN-ului genomic și manipularea și secvențierea fragmentelor de ADN au fost cele descrise anterior (1).

Mulțumiri

Mulțumim Dr. Mary Berlyn (Universitatea Yale, New Haven, CT) pentru darurile generoase și frecvente ale mutanților E. coli.

Note de subsol

  • ↵ * Cui îi trebuie adresată corespondența la: Boston University, 5 Cummington Street, Boston, MA 02215. E-mail: hlkbu.edu