Xiao-Lin Liu

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua Afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China

mir-192-5p

Hai-Xia Cao

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua Afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China

Bao-Can Wang

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua Afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China

Feng-Zhi Xin

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua Afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China

Rui-Nan Zhang

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua Afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China

Da Zhou

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua Afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China

Rui-Xu Yang

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China. nc.moc.demauhnix@oagnaijnaf

Ze-Hua Zhao

Qin Pan și Jian-Gao Fan, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua afiliat la Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai 200092, China

Corespondență cu: Jian-Gao Fan, dr., Profesor, Centrul pentru ficat gras, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Xinhua afiliat la Școala de Medicină a Universității Shanghai Jiao Tong, 1665 Road Kong Jiang, Shanghai 200092, China. nc.moc.demauhnix@oagnaijnaf

Abstract

Pentru a evalua nivelurile de miR-192-5p în modelele de boală hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) și a demonstra rolul miR-192-5p în acumularea de lipide.

METODE

Treizeci de șobolani Sprague Dawley au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri, cărora li s-a administrat o dietă standard, o dietă bogată în grăsimi (HFD) și o HFD cu injecție de liraglutidă. La sfârșitul celor 16 săptămâni, s-au măsurat nivelurile miR-192-5p hepatice și stearoil-CoA desaturază 1 (SCD-1). MiR-192-5p mimică și inhibitor și SCD-1 siARN au fost transfectate în celule Huh7 expuse la acidul palmitic (PA). Acumularea de lipide a fost evaluată prin colorarea cu ulei roșu de ulei și teste de trigliceride. Interacțiunea directă a fost validată prin teste ale genei reporter dual-luciferază.

REZULTATE

Șobolanii HFD au prezentat o scădere de 0,46 ori și o creștere de 3,5 ori a nivelurilor hepatice de proteine ​​miR-192-5p și SCD-1 comparativ cu martorii, care ar putea fi inversați după remisiunea bolii prin injecție cu liraglutidă (P Cuvinte cheie: miR-192-5p, Stearoyl-CoA desaturaza 1, Dieta bogată în grăsimi, Sinteza lipidelor, Boală hepatică grasă nealcoolică

Tipul de bază: Nivelurile hepatice de miR-192-5p au scăzut la modelele de șobolan cu steatohepatită nealcoolică hrănite cu o dietă bogată în grăsimi și scăderea ar putea fi inversată după remisia bolii prin terapia cu liraglutidă. miR-192-5p a arătat o interacțiune directă cu stearoil-CoA desaturaza 1 (SCD-1). Supraexpresia miR-192-5p a atenuat semnificativ acumularea de lipide în celulele Huh7 expuse la PA, iar SCD-1 siARN a abrogat depunerea lipidică agravată de inhibitorul miR-192-5p. Studiul nostru oferă dovezi că miR-192-5p participă la sinteza lipidelor în boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) prin SCD-1 și sugerează că supraexprimarea miR-192-5p poate reprezenta un tratament promițător pentru NAFLD.

INTRODUCERE

Stearoil-CoA desaturaza 1 (SCD-1) joacă un rol important în biosinteza acizilor grași mononesaturați și servește ca enzimă reglatoare cheie în ultima etapă a lipogenezei hepatice de novo (DNL). Creșterea DNL a fost confirmată la pacienții cu NAFLD comparativ cu martorii [15]. Activitatea SCD-1 hepatică îmbunătățită promovează acumularea de lipide hepatice, în special trigliceridele (TG) și, în consecință, duce la progresia NAFLD [16]. Cercetări recente au sugerat că expresia SCD-1 poate fi reglată prin căi dependente de SREBP-1c și independente de SREBP-1c [17], dar dacă SCD-1 poate fi reglat de microARN în NAFLD nu a fost studiat pe deplin.

Pentru a aborda întrebările de mai sus, am efectuat acest studiu pe șobolani alimentați cu diete bogate în grăsimi (HFD) și celule Huh7 tratate cu acid palmitic (PA). Nivelurile hepatice și hepatocelulare ale miR-192-5p în NAFLD au fost evaluate atât in vivo, cât și in vitro. Supraexprimarea și eliminarea miR-192-5p au fost efectuate în celulele Huh7 pentru a determina efectele reglatoare ale miR-192-5p în acumularea de lipide, iar testele de reporter luciferază au fost utilizate pentru a confirma interacțiunea directă dintre miR-192-5p și SCD-1 . Colectiv, am încercat să ilustrăm rolul miR-192-5p în metabolismul lipidelor hepatice în NAFLD.

MATERIALE ȘI METODE

Animale și tratament

Experimentul pe animale a fost conceput pentru a minimiza durerea sau disconfortul pentru animale. Un total de 30 de șobolani Sprague-Dawley masculi (în vârstă de 6 săptămâni) au fost achiziționați de la Shanghai Experimental Animal Center din Academia Chineză de Științe (Shanghai, China) și au fost adăpostiți în condiții de temperatură controlată (24 ° C ± 2 ° C ), umiditate (50% ± 5%) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore) cu acces gratuit la alimente și apă. După aclimatizare timp de o săptămână pe o dietă standard, au fost randomizați în trei grupuri (10 șobolani/grup). Grupul de control a primit o dietă standard; grupul HFD a fost hrănit cu HFD (88% dietă standard, 10% untură de porc și 2% colesterol); iar grupul de terapie a fost alimentat cu HFD și a primit injecții intraperitoneale de liraglutidă (Sigma, St. Louis, Statele Unite; 0,6 mg/kg în soluție salină) în ultimele 8 săptămâni. Acest experiment a urmat Ghidul Consiliului Național de Cercetare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din SHRM (SHRM-IACUC-001).

Colectarea și măsurarea probelor

La sfârșitul celor 16 săptămâni, șobolanii au fost eutanasiați după un post peste noapte. Părți din ficatul șobolanului au fost fixate în paraformaldehidă 4% peste noapte și încorporate în parafină pentru evaluări histologice cu colorare hematoxilin-eozină (H&E). Porțiunile rămase au fost congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C pentru colorarea cu roșu ulei O și alte analize. Nivelurile hepatice de TG ale șobolanilor au fost măsurate cu un kit de testare (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) conform instrucțiunilor producătorului.

Cultură de celule

Linia celulară Huh7 a fost obținută din colecția American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, Statele Unite) și cultivată în mediul de vultur modificat (DMEM) al lui Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS; Gibco, CA, Statele Unite) sub o atmosferă de 5% CO2 la 37 ° C. Pulberea PA (Sigma, St. Louis, Statele Unite) a fost dizolvată în apă Milli-Q suplimentată cu 1% BSA fără acizi grași 1% (Sigma, St. Louis, Statele Unite) la 70 ° C și filtrată printr-un filtru de 0,22 μm pentru a produce o soluție stoc de 5 mmol/L de PA. Soluția PA de lucru a fost adăugată la celule la 0,3 mmol/L și 0,5 mmol/L.

Detectarea viabilității celulare

Am efectuat măsurători de viabilitate celulară folosind kitul de numărare a celulelor-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele Huh7 au fost plasate pe o placă cu 96 de godeuri și s-au adăugat 0, 0,3 și 0,5 mmol/L de PA în mediu de cultură pentru 8, 16 și 24 de ore de incubație. Absorbanța CCK-8 a fost citită la 450 nm, iar valorile au fost normalizate la cele ale grupului de control.

Colorare roșie ulei O și test TG intracelular

Pentru colorarea cu roșu ulei, placa de cultură celulară a fost spălată de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat și fixată în 10% formalină neutră. Roșu ulei O (Sigma, St. Louis, Statele Unite) a fost dizolvat în izopropanol ca soluție stoc și a fost diluat 3: 2 cu ddH2O pentru a fi adăugat pe placă timp de 15 min, urmat de spălare în 60% izopropanol. Apoi, placa a fost contracolorată cu hematoxilină după clătire în apă distilată. Nivelurile intracelulare de TG din celulele Huh7 au fost măsurate folosind un kit de testare TG (Applygen Technologies Inc., Beijing, China) conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile de TG celulare au fost normalizate la conținutul lor de proteine.

miARN și transfecție mică de ARN interferent (siARN)

Celulele Huh7 au fost transfectate cu 50 nmol/L miR-192-5p mimic (Nr. Cat: miR10000222; Ribobio, Guangzhou, China), 200 nmol/L inhibitor miR-192-5p (Nr. Cat .: miR20000222; Ribobio, Guangzhou, China), 50 nmol/L SCD-1 siRNA (Nr. Cat.: StB0007776A; Ribobio, Guangzhou, China) și controlul lor negativ (NC; Ribobio, Guangzhou, China) conform instrucțiunilor producătorului cu Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Statele Unite) și mediul Opti-MEM (Gibco, CA, Statele Unite). Mediul a fost înlocuit cu DMEM cu 10% FBS după transfecție timp de 6 ore. Experimentele au fost efectuate la 24 de ore după transfecție.

Testul reporterului Luciferase

Secvența regiunii de sămânță de tip sălbatic (WT) sau mutant (Mut) a SCD-1 a fost donată într-un vector luciferază psiCHECK-2 (Promega, Madison, WI, Statele Unite) între siturile XhoI și NotI. După ce au fost așezate pe o placă cu 96 de godeuri, celulele 293T au fost transfectate cu 0,16 μg dintr-un vector de regiune netranslată (UTR) SCD-1 3 '(WT și Mut) și vectorul gol, precum și 50 nmol/L miR-192- 5p mimică, inhibitor de 200 nmol/L și NC-ul lor respectiv. Mediul de cultură a fost schimbat pentru a completa DMEM după 6 ore. Activitatea luciferazei a fost măsurată utilizând sistemul Promega Dual-Luciferase la 48 de ore după transfecție, iar activitatea relativă a luciferazei a fost calculată ca luciferază Renilla la luciferază Firefly.

Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei

Analiza Western blot

Probele de proteine ​​de 30 μg au fost analizate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 10% și apoi transferate în membranele de nitroceluloză. Membranele au fost blocate cu lapte degresat 5% în TBST timp de 2 ore la temperatura camerei și apoi incubate cu anticorp monoclonal de șoarece împotriva SCD-1 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie) și anticorp monoclonal de tubulină de șoarece (Beyotime, Shanghai, China) peste noapte la 4 ° C. Apoi, aceste membrane au fost spălate și incubate la temperatura camerei cu un anticorp secundar anti-șoarece (Beyotime, Shanghai, China) timp de 1 oră. Complexe imune au fost detectate folosind un substrat HRP chemiluminescent occidental (Millipore Corporation, Billerica, MA, Statele Unite).

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. O comparație statistică a fost făcută folosind un test t Student cu două cozi între două grupuri și o analiză unidirecțională a testului de varianță urmată de analizele Student - Newman - Kuels între mai multe grupuri. Diferențele au fost considerate semnificative la a cincea săptămână, toți șobolanii din grupul HFD au dezvoltat NASH cu steatoză hepatică macro-veziculară semnificativă, degenerare cu balon și inflamație lobulară. Greutatea corporală medie a șobolanilor HFD (661,7 ± 15,8 g) a fost mai mare decât cea a martorilor (566,7 ± 8,1 g, P Figura 1A-C). 1A -C). Analiza parametrilor biochimici serici la modelele animale a arătat că șobolanii HFD aveau niveluri mai ridicate de alanină transaminază (ALT), aspartat transaminază (AST) și niveluri de lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) și niveluri mai scăzute de lipoproteine ​​cu densitate înaltă (HDL) comparativ cu martorul. grup (P (Tabelul 1). 1). Rezultatele qRT-PCR au arătat că șobolanii HFD au scăzut nivelul hepatic de miR-192-5p (de 0,46 ori) în comparație cu martorii și că terapia cu liraglutidă ar putea abroga reducerea miR-192-5p la ficatul de șobolan HFD (P Figura1D). 1D). În plus față de scăderea nivelului hepatic de miR-192-5p, expresia proteinelor SCD-1 hepatică a fost semnificativ crescută (de 3,5 ori) la șobolanii hrăniți cu HFD, iar terapia cu liraglutidă ar putea reduce nivelurile hepatice de SCD-1 la șobolani HFD (P Figura 1E 1E).