Date asociate

REZUMAT

Introducere

Identificarea genelor care promovează creșterea duratei de viață este esențială pentru eforturile moderne de cercetare în gerontologie. În ultimul deceniu, cercetătorii au identificat numeroase gene și variante genetice care măresc durata de viață în sisteme de modele simple, cum ar fi S cerevisiae, C elegans și D melanogaster (Biteau și colab., 2011; Partridge, 2011) și analizele ulterioare în sistemele de mamifere. o bază genetică pentru longevitate. Durata de viață este, totuși, dependentă de specii și tulpini, iar longevitatea este doar parțial sub control genetic (Campisi și Yaswen, 2009; Rikke și colab., 2010; Sinclair și Michan, 2007). În consecință, restricția dietetică, care promovează în general longevitatea pe o varietate de specii de mamifere (Kapahi și Katewa, 2010), poate reduce, de asemenea, durata de viață într-o manieră dependentă de tulpină (Nelson și colab., 2010). Longevitatea la mamifere, în absența prădării sau a bolii, este, prin urmare, o consecință a unei varietăți de acțiuni genetice și a proceselor metabolice și este în prezent imposibil să se știe a priori dacă un anumit produs genetic va promova o durată de viață crescută (Martin, 2002; Zahn și colab., 2007). Această incertitudine este complicată de faptul că unele gene asociate longevității pot funcționa într-un mod specific organului.

Pentru a elucida în continuare baza moleculară a variabilității duratei de viață normale la mamifere, am postulat că CM exprimă seturi unice de gene legate de supraviețuire. Pentru a testa această ipoteză, am investigat expresia genelor în inimi de la trei pete de șobolan cu durate de viață absolute diferite. Raportăm identificarea unui set unic de gene predictiv al mortalității și a unui factor de transcripție (TF) direct implicat în pierderea CM. Acest TF este reglat în mod eterogen în CM in vivo și promovează în mod specific necroza programată in vitro, care contribuie, cel puțin parțial, la componenta cardiacă a eterogenității longevității observată la șobolani.

Rezultate

Analize microarray și predicția genelor putative asociate longevității

Pentru a identifica transcrierile cu o abundență modificată predictivă a duratei de viață relativă, am generat profiluri transcriptomice ale inimilor masculine Fisher (F) 344 și ale inimilor de șobolani Wistar în funcție de vârstă (Fig. 1 și S1A). În loc să raportăm doar diferențe semnificative și modificări ale abundenței transcrierilor, am „corectat” variabila absolută „vârstă” în „durată de viață relativă” și am reorganizat toate datele microarray în grupuri de mortalitate (de exemplu, clase) pe baza probabilității cumulative de a muri la o vârstă specificată în cadrul fiecărei cohorte de șobolani (Fig. 1 și S1B, Tabelul 1). Apoi am analizat datele reorganizate și combinate de la ambele tulpini, folosind o variantă a celei mai apropiate clasificări de centroid micșorat, numită Analiza de predicție a microarrays-urilor (PAM), care a fost inițial dezvoltată pentru a clasifica și prezice caracteristicile de diagnostic ale probelor de cancer. Am folosit în mod specific PAM pentru a prezice grupurile de mortalitate pe baza profilurilor de expresie genică și a curbelor relative de mortalitate (Schaner și colab., 2003; Sorlie și colab., 2003). „Antrenamentul” PAM a fost apoi utilizat pentru a identifica transcrieri genetice al căror centru a fost stabil în probe din aceeași clasă de la șobolani F344 și Wistar, iar validarea încrucișată PAM a fost utilizată pentru a identifica statistic un set minim de transcrieri genetice (n = 252) a caracterizat fiecare clasă (Fig. 2A). Erorile testului PAM au fost de asemenea calculate pentru precizia predicției (Fig. 2B).

profilurilor

Acest studiu a fost conceput pentru a utiliza seturi de date microarray, normalizate la „durata de viață relativă” pentru a identifica transcripțiile genetice predictive ale grupurilor de longevitate. Datele au fost grupate, factorii cis și trans identificați și datele analizate în funcție de mortalitate folosind 3 tulpini de șobolan. Datele rezultate au fost folosite pentru a identifica TF-uri independente de tulpină și dependente de vârstă care au mimat și, eventual, au reglementat expresia setului de gene informative. Au fost efectuate teste funcționale pentru a determina modul în care un factor ar putea contribui la variabilitatea longevității la rozătoare.

tabelul 1

Grupuri de vârstă și mortalitate relativă

Micro tulpini de tulpini de șobolani Grupuri de mortalitate cu alte studii
Fisher 344 (F344) 1-3 zile (NNCM)
3 luni (ACM)0%
6 luni60
12124
18188
242430
303080
Wistar (W)6 luni6 luni0%
12124
1817/188
23/2423/2430
272780
Fisher × Brown Norvegia (F/N) 2 luni0%
6 luni60
124
168
2420
3230
363680

Microarrays au fost efectuate pe probe de inimă de șobolan grupate (n = 4) obținute la vârstele indicate. Comparațiile au fost efectuate cu șobolani în vârstă de 6 luni, potrivite pentru tulpină, când se presupunea că mortalitatea cauzată de îmbătrânire se apropia de 0%. Altele se referă la testele efectuate pe probe de țesut sau celule obținute din cardiomiocite neonatale de șobolan (NNCM), cardiomiocite adulte (ACM) sau fibroblaste de șobolan (rFbs) la grupele de vârstă indicate. Acestea includ qRT-PCR (șobolani F344, W și F/N), analize de proteine ​​(șobolani F344 și F/N) sau imunohistochimie (F/N) așa cum este descris în text.

O caracteristică definitorie a tuturor celor 252 de transcrieri identificate de PAM ca funcție a grupului de mortalitate a fost forma sincronizată (Fig. 2C). Grafic, transcrierile din grupul de animale vii cu 80% mortalitate în fiecare tulpină respectivă (Tabelul 1) au avut o abundență egală sau mai mare decât cea identificată în cohorte la 4% mortalitate relativă (adică, atunci când mortalitatea este esențial absentă). Pentru grupul de mortalitate relativă de 8%, când se prevede că 92% din cohortă va supraviețui, transcrierile au fost mai puțin abundente decât cele găsite în grupul de mortalitate relativă de 4%, dar doar 30 din 252 de transcrieri au fost semnificativ reduse (p rd tulpina de șobolan (Fisher × Șobolani Brown Norway (F/N)) care au un

Durată de viață cu 50% mai lungă decât șobolanii F344 sau Wistar (Fig. 1 și S1B). Mai exact, am utilizat PAM pentru a determina gradul de asemănare între inimile de șobolan F/N în vârstă de 36 de luni (mortalitate relativă de 80%) și seturile de date microarray de șobolan F344 și Wistar modelate anterior. Am postulat că, dacă centrul setului de gene de „supraviețuire” ar fi stabil în cadrul eșantioanelor din aceeași clasă de șobolani Wistar și F344 (adică, independent de tulpină și variabilitatea aleatorie), atunci analiza ar trebui să prezică corect grupul de supraviețuire al celei de-a treia tulpini bazat în întregime pe profilul de expresie conservat al probei de testare. Rezultatele acestei analize au indicat că modelul de expresie al genei de supraviețuire 252 identificat la șobolanii F344 și Wistar ar putea de fapt să prezică cu precizie (cu o probabilitate posterioară egală cu unitatea, adică 100% exactă) mortalitatea relativă de 80% în testul 3 din 4 grupuri de șobolani F/N, în concordanță cu precizia de predicție de 82% determinată din testele PAM (Fig. 2B). Aceste date ne conduc la concluzia că acest set de gene este de fapt predictiv pentru grupurile de mortalitate relativă (adică supraviețuire) în inimile șobolanilor, independent de tulpină și variabilitatea aleatorie.

Identificarea elementelor cis comune și a factorilor trans-de reglementare

Profilurile de expresie conservate ale genelor de „supraviețuire” printre tulpini sugerează că componentele genetice (de exemplu, elementele cis și factorii trans-reglatori) sunt responsabili de tiparul unic de expresie afișat de acest set predictiv de gene. Prin urmare, am identificat site-uri de legare supuse TF (adică, elemente de reglare cis) în promotorii genei rozătoarelor corespunzători (Dohr și colab., 2005). După un test Gap și gruparea K-înseamnă pentru a sorta transcrierile genetice predictive în 3 grupe genetice (Fig. 1, Tabelele S3 și S4), am identificat familii comune de elemente cis în cel puțin 80% din regiunile promotorului proximal (−500 până la +100 în raport cu locul de pornire al transcrierii) în cadrul fiecărui cluster (Tabelul S5, Fig 2D). În Cluster 1, 80% din gene conțineau site-uri de legare TF pentru membrii familiei Ets, Creb, Nkx/Dlx, E-box și Irf. În Cluster 2, elementele cis conservate pentru familiile Stat-, Ets și Egr- TF au fost identificate în 90% din gene; și în Cluster 3, site-urile de legare a transcripției familiei Creb și Ets au fost comune. Numai membrii familiei Ets au fost conservați în toate cele trei grupuri.

Când aceste analize au fost extinse la șobolani F/N care corespund acelorași grupuri de mortalitate (Tabelul 1), 6 din 24 factori transregulatori putativi au arătat modificări semnificative în abundența transcriptului, dar doar patru dintre acești ARNm (Ets2, Erg, Max și Msx2 ) a avut o modificare semnificativă a expresiei la toate cele 3 tulpini (Tabelul S6). Dintre acestea, numai Ets2 a demonstrat o corelație semnificativă (ca relație inversă) cu fiecare grup de gene din fiecare grup de mortalitate pentru toate cele trei tulpini de șobolan (Fig. 2E). Comparativ cu grupul de mortalitate relativă de 4%, abundența transcriptului Ets2 a fost întotdeauna mai mare în 8%, dar mai mică în grupurile de mortalitate relativă de 30 și 80%. Statistic, acest profil nu a diferit (p = 0,7) de inversul expresiei Ets2 pentru oricare dintre cele 252 de transcrieri genetice predictive. Celelalte trei TF-uri au fost corelate pozitiv cu expresia genică la una sau două tulpini de șobolan, dar nu la toate (Fig. S1D).

ETS2 în inimile de șobolan F344 și F/N cu îmbătrânire

(A) Imunoblot și analiza datelor pentru ETS1 și ETS2 în inima de șobolan F344 din fiecare grup de mortalitate relativă (4, 8, 30 și 80%). (B) Imunocolorarea ETS2 a țesuturilor cardiace de la șobolani F/N la a) 2, b) 16, c) 24 și d) vârsta de 32 de luni. ETS2 (Brown) și TUNEL (Violet) co-colorare a inimilor de la animale în vârstă de 16 luni sunt prezentate în e - g, cu măriri afișate în f și h. Colorarea maro închis în e ilustrează niveluri ridicate de ETS2 prezentate în anumite regiuni ale miocardului. Săgețile indică CM TUNEL pozitive (f). g și h prezintă TUNEL pozitive non-CM care nu au colorare puternică ETS2. (C) Imunoblot și analiza datelor pentru abundența de proteine ​​ETS1 și ETS2 în rFB, NNCM și cardiomiocite ventriculare stângi adulte (AdCM), p Fig. 3C). Mai mult, agoniștii farmacologici cunoscuți că afectează creșterea și funcționarea CM modifică tranzitoriu abundența și expresia ETS2 exclusiv în NNCM. Fenilefrina (PE), izoproterenolul (ISO) și, într-o măsură mai mică, angiotensina II (AngII) au dus la modificări morfologice specifice ale NNCM, dar numai PE și ISO au determinat creșterea frecvenței bătăilor celulelor placate. În aceste aceleași celule, abundența ETS2 a crescut semnificativ de 3 și 1,6 ori ca răspuns la ISO (ANOVA, p = 0,006, n = 5) și PE (ANOVA, p = 0,004, n = 5), respectiv relativ la proteina totală în termen de 24 de ore de la tratament (Fig. 3D). Nu s-a observat nicio modificare semnificativă a ETS2 la CM după tratamentul cu AngII. În mod similar, nu s-au putut demonstra modificări semnificative în ARNm sau proteină Ets1 sau Ets2 în rFB-uri cu oricare dintre acești agoniști în orice moment examinat. Aceste date demonstrează că reglarea ascendentă a ETS2 a apărut la CM, dar nu la FB ca răspuns la agoniști simpatici, și că expresia acesteia este mai răspândită la CM adulți decât la NNCM.

ETS2 crescut favorizează moartea celulelor cardiomiocitare

Necroza programată indusă de ETS2

Formele de moarte celulară independente de caspază pot fi induse de endonuclează G (Endo G), de factorul inducător de apoptoză (AIF) sau de proteina necesară temperaturii ridicate A2 (HtrA2/Omi) (Bae și colab., 2008; Siu și colab. ., 2007). Toate cele trei proteine ​​au fost detectate în NNCM infectate; cu toate acestea, nicio modificare semnificativă a abundenței pentru oricare dintre acești factori nu a putut fi demonstrată după supraexprimarea ETS2 (Fig. S1F, p> 0,05). În mod neașteptat, atât formele active (57kDa), cât și cele inactive ale AIF (67kDa) au fost observate în NNCM infectate cu adenovirus (Fig. 5A), iar nivelurile ridicate de ETS2 au determinat în mod specific AIF să se transloce din fracțiunea mitocondrială (inactivă) în fracțiile citoplasmatice și nucleare. (activ) (Fig. 5B, vezi săgețile). Nu s-au observat translocări ale Endo G sau HtrA2 din compartimentele mitocondriale în compartimentele citosolice sau nucleare (nereprezentate). Cantitativ, conținutul FIA a crescut cu

De două ori în fracțiunea nucleară a NNCM infectată cu Ad-ETS2 în comparație cu martorii (p = 0,02, n = 4), iar AIF activ a fost observat cu ușurință în citoplasma și nucleele acestor celule (Fig. 5B, C). Astfel, AIF, dar nu și alți activatori ai formelor de moarte celulară independente de caspază, este activat ca răspuns la supraexprimarea ETS2 în NNCMs.

Discuţie

Prezentul studiu a profitat de datele privind expresia genelor și PAM pentru a identifica transcrierile genetice care prevăd durata de viață relativă. Setul de gene identificat aici a arătat o expresie „stabilă” cu un profil unic care a avut o pantă pozitivă în cohortele de animale de la 8% la 80% mortalitate. Teoretic, acest profil ar putea fi atins fie prin mecanisme transcripționale, fie post-transcripționale. Pentru a discrimina aceste posibilități, am utilizat o componentă a PAM pentru a „testa” (adică, a prezice) grupul de mortalitate de 80% la șobolani F/N în vârstă de 36 de luni pe baza analizei transcriptomice agregate a șobolanilor Wistar și F344. Trei „teste” PAM au indicat faptul că profilul de expresie al genei predictive 252 setate la șobolani F/N a fost semnificativ corelat cu grupul de mortalitate de 80% din celelalte două tulpini de șobolan (cu o probabilitate posterioară egală cu unitatea). Faptul că această determinare bazată pe transcriptomic ar putea identifica un grup dintr-o a treia tulpină de șobolan cu o durată de viață mai lungă demonstrează că variația normală a abundenței transcriptului printre probele de miocard este mai puțin importantă decât mecanismele biologice conservate responsabile de controlul modificărilor în expresia genelor care apar ca funcția duratei vieții și nu doar vârsta absolută.

În timp ce această interpretare a fost potențial confundată de variabilitatea tipului de celulă, diferențele dintre abundența ARN și proteine ​​și mecanismele de reglare post-transcripțională, am identificat cel puțin un TF (ETS2) a cărui expresie a fost puternic, dar invers corelată cu setul de gene 252 „stabil”. Arătăm că ETS2, care este exprimat în principal în CM, prezintă modele de exprimare dependente de vârstă, este receptiv la stimuli simpatici (PE și ISO) și funcțional, promovează necroza programată a CM. La inimile adulte din grupurile de mortalitate de 8% din 3 tulpini de șobolani, ETS2 prezintă o variabilitate considerabilă de la celulă la celulă și, atunci când este prezentă la niveluri ridicate, se observă co-colorarea TUNEL. Nu a fost observată o astfel de corelație în niciun alt grup de mortalitate examinat. Din punct de vedere mecanic, pierderea mediată de ETS2 a CM implică activarea axei PARP1-AIF pentru a activa necroza celulară programată și, eventual, activarea secundară a apoptozei. Deoarece axa PARP1-AIF este implicată în mod complex cu semnalizarea necrotică, concluzionăm că ETS2 activează în mod specific această cale de semnalizare în CM pentru a promova moartea celulară in vitro și in vivo (Hong și colab., 2004; Kung și colab., 2011). Acestea fiind spuse, sistemul de adenovirus pe care l-am folosit pentru a exprima excesiv ETS1 și ETS2 a dus la niveluri foarte ridicate (

50–100 de ori) de exprimare. Acest lucru duce la întrebări cu privire la faptul dacă modificările comportamentului celular observate sunt relevante pentru acțiunea proteinei la niveluri in vivo mai fiziologice și ar trebui să se ia o anumită precauție atunci când se interpretează aceste date. Viitoare experimente cu un sistem mai reglementat vor fi necesare pentru a aborda această problemă. În ciuda acestor limitări, descoperirile noastre oferă o explicație parțială a motivului pentru care pierderea celulelor CM și a precursorului apare la adulții tineri până la vârsta de 12 luni (Anversa și colab., 1990; Chimenti și colab., 2003), înainte de momentul în care mortalitatea la șobolani crește exponențial.