Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Departamentul de Chirurgie, Universitatea de Medicină și Stomatologie - Școala de Medicină din New Jersey, Newark, New Jersey 01703

Departamentul de Chirurgie, Universitatea de Medicină și Stomatologie - Școala de Medicină din New Jersey, Newark, New Jersey 01703

Departamentul de Chirurgie, Universitatea de Medicină și Stomatologie - Școala de Medicină din New Jersey, Newark, New Jersey 01703

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Departamentul de Chirurgie, Universitatea de Medicină și Stomatologie - Școala de Medicină din New Jersey, Newark, New Jersey 01703

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; și

Abstract

Inozina, o purină naturală formată din descompunerea adenozinei, s-a dovedit recent că exercită efecte antiinflamatoare puternice atât in vivo, cât și in vitro. Acest studiu a evaluat inozina ca o terapie potențială pentru colită. Colita a fost indusă la șoareci prin administrarea de dextran sulfat de sodiu (DSS). Tratamentul oral cu inozină a început fie înainte de apariția colitei, fie ca post-tratament, odată ce colita a fost stabilită. Evaluarea afectării și inflamației colonului a fost determinată grosolan (greutate corporală, sângerare rectală), histologic și biochimic (nivelurile de colon de MPO, MDA și citokine). Colita indusă de DSS a crescut semnificativ infiltrarea celulelor inflamatorii în colon. Colita indusă de DSS a crescut, de asemenea, nivelurile de colon de peroxidare a lipidelor, citokine și chemokine. Inozina a protejat colonul de infiltrarea celulelor inflamatorii induse de DSS și de peroxidarea lipidelor. De asemenea, inozina a redus parțial acești parametri într-un model experimental de colită stabilită. Astfel, tratamentul cu inozină poate fi o terapie potențială în colită.

Reactivii au fost obținuți din următoarele surse: DSS (MW 40.000) a fost de la ICN Pharmaceuticals; inozină, MPO uman, 1,1,3,3-tetrametoxipropan, acid tiobarbituric, dodecil sulfat de sodiu, tetrametilbenzidină, bromură de hexadeciltrimetilamoniu și peroxid de hidrogen proveneau din Sigma (St. Louis, MO); Șoarecii BALB/c provin de la Taconic Farms (Germantown, NY); și kituri specifice ELISA pentru citokine au fost de la R&D Systems (Minneapolis, MN).

Inducerea colitei și tratament.

Șoareci masculi BALB/c, cu vârsta de 8 săptămâni, cu o greutate de 20-23 g au fost folosiți pentru aceste studii. Animalele sunt adăpostite în încăperi la o temperatură controlată și un ciclu lumină-întuneric timp de 48 de ore înainte de a începe protocoalele experimentale. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu „Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator” [Publicația DHEW nr. (NIH) 85-23, revizuit 1985, Biroul de științe și rapoarte de sănătate, DRR/NIH, Bethesda, MD 20205] și cu aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor Inotek.

Șoarecii au fost hrăniți cu 5% DSS, masă moleculară 30-40 kDa dizolvată în apă distilată ad libitum pe tot parcursul experimentului (31). Inozina a fost administrată pe cale orală prin gavaj sau intraperitoneal de două ori pe zi. Șoarecii martori au fost tratați cu vehicul, care a fost fie apă pentru protocolul experimental de inozină orală, fie soluție salină pentru protocolul experimental de inozină intraperitoneală. Pentru experimentele de tratament cu inozină întârziată, șoarecilor li s-a administrat vehicul până în ziua în care a început tratamentul cu inozină. Inozina a fost administrată la doze cuprinse între 25 și 200 mg · kg -1 -1 zi -1 și s-a bazat pe studii recente de testare a inozinei pe modele de inflamație la rozătoare (14, 18, 25). Aportul soluției DSS a fost monitorizat pe parcursul experimentelor și sa dovedit a fi neschimbat în rândul grupurilor experimentale (datele nu sunt prezentate).

Evaluarea severității colitei și a efectelor medicamentoase.

Parametrii înregistrați în experimente au fost greutatea corporală, lungimea colonului, mortalitatea și sângerarea din rect, determinate de inspecția oculară. Șoarecii au fost cântăriți zilele 1 și 10cu modificarea ulterioară a greutății indusă de colită exprimată ca procent din greutatea inițială. Șoarecii au fost uciși prin luxație cervicală, iar colonul a fost rezecat între joncțiunea ileocecală și rectul proximal, aproape de trecerea sa sub pelvistern. Colonul a fost plasat pe o suprafață neabsorbantă și măsurat cu o riglă. Biopsiile colonice au fost luate pentru analize histologice și biochimice. O biopsie a fost fixată în 15% formaldehidă, încorporată în parafină și secționată (felii de 4 μm). Secțiunile au fost apoi colorate cu hematoxilină și eozină și vizualizate de un investigator (orbit) și au fost punctate pentru severitatea inflamației (0 = niciuna, 1 = ușoară, 2 = moderată și 3 = severă) și extinderea (0 = niciuna, 1 = mucoasă, 2 = mucoasă și submucoasă și 3 = transmurală, precum și deteriorarea criptelor (0 = niciuna, 1 = 1/3 bazală, 2 = 2/3 bazală, 3 = criptele pierdute prezente epiteliu și 4 = criptele și epiteliul de suprafață pierdut), cu secțiuni reprezentative afișate aici.

Activitatea MPO.

Biopsiile de colon au fost omogenizate (50 mg/ml) în bromură de hexadeciltrimetilamoniu 0,5% în 10 mM MOPS și centrifugate la 15.000 g timp de 40 min. Suspensia a fost apoi sonicată de trei ori timp de 30 de secunde. O alicotă a supernatantului (20 pl) a fost amestecată cu o soluție de 1,6 mM tetrametilbenzidină și 1 mM peroxid de hidrogen. Activitatea a fost măsurată spectrofotometric ca schimbarea absorbanței la 650 nm la 37 ° C, folosind un cititor de microplăci Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Rezultatele sunt exprimate ca miliunități de activitate MPO per miligram de proteine, care au fost determinate cu testul Bradford.

Test de malondialdehidă.

Formarea malondialdehidei a fost utilizată pentru a cuantifica peroxidarea lipidelor în colon și a fost măsurată ca material reactiv la acid tiobarbituric. Țesuturile au fost omogenizate (100 mg/ml) în tampon KCl 1,15%. Două sute de microlitri de omogenate au fost apoi adăugate la un amestec de reacție format din 1,5 ml acid tiobarbituric 0,8%, 200 μl 8,1% dodecil sulfat de sodiu, 1,5 ml acid acetic 20% (pH 3,5) și 600 μl H2O distilat. Amestecul a fost apoi încălzit la 90 ° C timp de 45 min. După răcire la temperatura camerei, probele au fost eliminate prin centrifugare (10.000 g, 10 min) și absorbanța lor a fost măsurată la 532 nm folosind 1,1,3,3-tetrametoxipropan ca standard extern. Nivelul peroxizilor lipidici a fost exprimat ca nanomoli MDA pe miligram de proteine ​​(test Bradford).

Nivelurile de citokine ale colonului.

O a treia biopsie a colonului a fost îndepărtată și a fost congelată în azot lichid, proba a fost apoi omogenizată în 700 pl dintr-un tampon Tris · HCI conținând inhibitori de protează. Probele au fost centrifugate timp de 30 de minute și supernatantul a fost înghețat la -80 ° C până la testare. Nivelurile de citokine au fost determinate utilizând ELISA.

analize statistice.

Rezultatele sunt prezentate ca mijloace ± SE; analiza statistică a fost preformată folosind fie ANOVA unidirecțională, urmată de comparații multiple Student-Newman-Keuls după analiza post-hoc, testul exact al lui Fisher, Mann-Whitney U-test, sau analiza supraviețuirii Kaplan-Meier, după caz, cu un P valoarea −1 · zi −1 inozinei intraperitoneal, respectiv. În mod similar, sângerarea rectală a fost redusă semnificativ de la 60 la 10 și 0%. De asemenea, am examinat nivelurile de colon ale MPO și MDA; în ambele cazuri, inozina a redus semnificativ nivelurile în comparație cu animalele tratate cu vehicule. Nivelurile MPO au fost reduse de la 337 ± 60 la 101 ± 21 și 69 ± 16 mU/mg proteină cu 100 sau 200 mg · kg -1 -1 zi-1 tratament cu inozină. În mod similar, nivelurile de MDA au fost reduse de la 3,5 ± 0,5 la 1,9 ± 0,3 nmol/mg proteină cu 200 mg · kg -1 · zi -1 inozină. Nivelul MDA în colon după 100 mg · kg -1 -1 zi-1 ip inozină a fost de 2,5 ± 0,4 nmol/mg proteină, ceea ce nu a fost semnificativ diferit statistic de colonul tratat cu vehicul.

Tabelul 1. Doza de inozină atenuează în mod dependent semnele distinctive ale colitei experimentale

Datele sunt exprimate ca medii ± SE de la 10-20 de animale. Șoarecii masculi Balb/c au fost expuși la soluția de dextran sulfat de sodiu (DSS) (5% în greutate/vol) ad libitum. Inozina (25, 50, 100 sau 200 mg · kg -1 - zi -1) a fost administrată pe cale orală de două ori pe zi începând cu ziua 1 și peziua 10 experimentul a fost încheiat. Colonul a fost disecat și măsurat. Analiza statistică a fost efectuată folosind ANOVA unidirecțional, urmată de comparații multiple Student-Newman-Keuls după analiza post-hoc sau testul exact al lui Fisher, unde P * P † P ‡ P F1-153 P

supraviețuirea

FIG. 1.Inozina reduce în mod dependent nivelurile de MPO (A) și malondialdehidă (MDA)B) la colonii de șoareci cu inflamație acută a colonului indusă de dextran sulfat de sodiu (DSS). Șoarecii au fost expuși la DSS ad libitum timp de 10 zile, tratamentul cu inozină (25, 50, 100 sau 200 mg · kg -1 -1 zi -1, de două ori pe zi) a început în ziua I. Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SE de la 8-20 de animale, analiza statistică a fost realizată de ANOVA unidirecțională, urmată de comparații multiple Student-Newman-Keuls după analiza post-hoc în care P


FIG. 2.Efectul inozinei (200 mg · kg -1 -1 zi -1) asupra modificărilor morfologice observate la colonul șoarecilor tratați cu DSS timp de 10 zile. Inozina a fost administrată pe cale orală începând cuziua 1. El ziua 10, șoarecii au fost uciși și biopsiile de colon au fost luate și fixate în soluție de formalină 10%. Probele au fost încorporate în parafină și secționate (secțiuni de 3 μm). Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină și au fost vizualizate la mărirea × 100 sau × 400. Secțiunile prezentate sunt reprezentative pentru secțiunile de la 10 șoareci. Mărirea primelor două coloane este × 100 și a treia coloană, × 400.

Tabelul 2. Analiza histologică a secțiunilor colonice din vehicul, DSS+ vehicul și șoareci tratați cu inozină DSS +

Scorurile sunt prezentate ca medii ± SE de la 10 animale. Șoarecii masculi Balb/c au fost expuși la soluția DSS (5% în greutate/vol) ad libitum. Inozina (200 mg · kg -1 -1 zi -1) a fost administrată pe cale orală de două ori pe zi începând cu ziua 1. Elziua 10, șoarecii au fost sacrificați și biopsiile de colon au fost luate și fixate în soluție de formol 10%. Probele au fost încorporate în parafină și secționate (secțiuni de 3 μm). Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină și au fost vizualizate la mărirea × 400 și au fost punctate orb pentru severitatea inflamației (0 = niciuna, 1 = ușoară, 2 = moderată și 3 = severă) și extinderea (0 = niciuna, 1 = mucoasa, 2 = mucoasă și submucoasă și 3 = transmurală), precum și deteriorarea criptelor (0 = niciuna, 1 = 1/3 bazală, 2 = 2/3 bazală, 3 = criptele pierdute prezente epiteliu și 4 = criptele și epiteliul de suprafață pierdute). Analiza statistică a fost efectuată folosind Mann-Whitney U-test, unde

* = un cu două coziP valoarea de 0,0524,

† = un cu două cozi P valoarea de 0,0068 și

‡ = un cu două cozi P valoarea de 0,036 vs. grupul de tratament al vehiculului DSS +.

Inozina atenuează parțial simptomele bolii în colita stabilită. Șoarecii tratați cu 200 mg · kg -1 -1 zi-1 inozină începând cu ziua 4 sau 7 după începerea DSS a avut o lungime a colonului crescută, dar nu a avut niciun efect asupra pierderii de greutate corporală mediată de colită sau asupra incidenței sângerărilor rectale (Tabelul 3). Tratamentul șoarecilor pe ziua 4 cu inozină au avut, de asemenea, niveluri mai mici de colon atât de MPO, cât și de MDA (Tabelul 3). În experimentele de supraviețuire pe termen lung, șoarecii tratați cu 5% DSS timp de 30 de zile au prezentat o rată de mortalitate de 100% cu 20 de zile (Fig. 3). În schimb, șoarecii tratați cu inozină (200 mg · kg -1 -1 zi -1) începând cu ziua 1, 4, sau 7 au arătat o creștere semnificativă a supraviețuirii cu 100, 70 și, respectiv, 30% șoareci în viață ziua 20, și chiar mai departe ziua 30, 60, 20 și 10% dintre șoareci erau încă în viață (Fig. 3).

Tabelul 3. Inozina atenuează semnele distinctive ale bolii în colita experimentală stabilită

Datele sunt mijloace ± SE de la 10-12 animale. Inozina (200 mg · kg -1 -1 zi -1) a fost administrată pe cale orală de două ori pe zi începând cu ziua 1, 4, sau 7 după începerea tratamentului DSS. Elziua 10, experimentul a fost încheiat și animalele sacrificate. Colonul a fost disecat și măsurat. Au fost luate biopsii pentru determinarea nivelurilor de colon ale mieloperoxidazei (MPO) și malondialdehidă (MDA). Analiza statistică a fost efectuată folosind ANOVA unidirecțional, urmată de comparații multiple Student-Newman-Keuls după analiza post-hoc sau testul exact al lui Fisher, unde P

FIG. 3.Tratamentul cu inozină îmbunătățește semnificativ supraviețuirea șoarecilor cu inflamație acută a colonului. Șoarecii au fost expuși la DSS ad libitum timp de 30 de zile, tratamentul cu inozină (200 mg · kg -1-1 zi -1 de două ori pe zi) a început zile l, 4, și7. A fost înregistrat numărul șoarecilor care au supraviețuit în fiecare zi. Rezultatele sunt exprimate ca% de supraviețuire de la 20 de animale. Analiza statistică a fost efectuată utilizând o analiză de supraviețuire Kaplan-Meier, undeP

Efectul inozinei asupra profilului citokinei colonului.

Șoarecii tratați cu DSS au crescut foarte mult nivelurile de colon ale chimiokinelor și citokinelor inflamatorii (Fig. 4, A șiB). Șoarecii netratați au avut niveluri de chimokine sau citokine de colon nedetectabile (datele nu sunt prezentate). Inozina (200 mg · kg -1 -1 zi -1) a redus semnificativ nivelurile de colon ale chimiokinelor (Fig.4A) proteine ​​intrinseci majore (MIP) -1 și -2 și citokine proinflamatorii (Fig. 4B) IL-1, IL-6 și IL-12. Inozina a fost, de asemenea, capabilă să atenueze nivelurile de colon ale TNF (Fig. 4B).

FIG. 4.Efectul inozinei asupra chemokinei colonului (A) și citokină (B) niveluri după colită. Nivelurile de citokine au fost determinate în biopsiile de colon de la șoareci tratați timp de 10 zile cu DSS ± inozină (200 mg · kg -1 -1 zi -1). Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SE de la 10 animale. Analiza statistică a fost realizată de ANOVA unidirecțională urmată de comparații multiple Student-Newman-Keuls după analiza post-hoc, undeP

De asemenea, s-a demonstrat că inozina inhibă enzima poli (ADP-riboză) sintetază (PARS), deși la concentrații mari (41). Inhibarea PARS sa dovedit a fi benefică în multe boli inflamatorii (37), inclusiv colita experimentală la șoarece (44) și șobolan (29). Inozina poate îmbunătăți, de asemenea, sistemele antioxidante endogene, deoarece defalcarea inozinei produce urat, un agent de eliminare a oxiradicalelor și peroxinitritului (1, 4, 20,39), ambele fiind implicate în patogeneza colitei (36, 43). De asemenea, am examinat eficacitatea unui catalizator specific de descompunere a peroxinitritului în colită și am constatat că este protector (23). Cu toate acestea, efectele unui peroxinitrit scavenger asupra infiltrării celulelor imune și a nivelului de citokine/chemokine în colonul șoarecilor colitici a fost minim și nu se compară cu ceea ce am observat cu tratamentul cu inozină, dovezi suplimentare ale unui mecanism antiinflamator sistemic de acțiune a inozinei colita.

Natura posttranscripțională a acțiunii inozinei atât asupra eliberării citokinelor, a inhibării PARS, cât și a producției de urați poate fi considerată preferabilă, deoarece s-ar aștepta o fereastră crescută de oportunitate terapeutică, adică, inozina poate rămâne eficientă într-o paradigmă post-tratament. Într-adevăr, datele noastre sugerează că inozina este capabilă să atenueze colita stabilită. De asemenea, s-a demonstrat că purinele promovează vindecarea ulcerelor intestinului subțire în enterocolita experimentală (40) și, de asemenea, aceasta poate juca un rol în efectele de protecție posttratament ale inozinei în colită. Promovarea reparării mucoasei deteriorate de către inozină poate explica scăderea celulelor inflamatorii care se infiltrează în colon.

În concluzie, am demonstrat eficacitatea inozinei ca terapie de protecție într-un model experimental de colită murină. Inozina nu numai că a putut preveni dezvoltarea colitei, dar a avut și un efect benefic asupra bolii stabilite. Datele actuale, împreună cu înregistrarea excelentă a siguranței inozinei, sugerează că conceptul de testare și dezvoltare a inozinei ca terapie cu colită la om poate fi justificat.

Acest studiu a fost susținut de National Institutes of Health Grants R43-DK-57379 (către A. L. Salzman) și RO1-GM-66189-01 (către G. Hasko).

NOTĂ DE PICIOASĂ

Dr. J. G. Mabley, P. Pacher și A. Marton sunt angajați ai Inotek Pharmaceuticals; Dr. C. Szabó și A. L. Salzman sunt angajați, proprietari și acționari ai Inotek Pharmaceuticals.

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: J. G. Mabley, Inotek Pharmaceuticals, Suite 419E, 100 Cummings Center, Beverly, MA 01915 (E-mail: [email protected] com).