Inhibarea expresiei inflamatorii a citokinelor previne leziunile renale induse de dietă bogată în grăsimi: rolul suplimentării lingonberry

Susara Madduma Hewage

1 Centrul canadian de cercetare agroalimentară în sănătate și medicină, St. Spitalul Boniface Albrechtsen Research Center, Winnipeg, MB, Canada

2 Departamentul de Fiziologie și Fiziopatologie, Universitatea din Manitoba, Winnipeg, MB, Canada

Suvira Prashar

1 Centrul canadian de cercetare agroalimentară în sănătate și medicină, St. Spitalul Boniface Albrechtsen Research Center, Winnipeg, MB, Canada

3 Agricultură și Agroalimentare Canada, St. Spitalul Boniface Albrechtsen Research Center, Winnipeg, MB, Canada

Samir C. Debnath

4 Agricultură și Agroalimentare Canada, St. Centrul de Cercetare și Dezvoltare Sf. Ioan, St. John's, NL, Canada

Carmine O

1 Centrul canadian de cercetare agroalimentară în sănătate și medicină, St. Spitalul Boniface Albrechtsen Research Center, Winnipeg, MB, Canada

2 Departamentul de Fiziologie și Fiziopatologie, Universitatea din Manitoba, Winnipeg, MB, Canada

5 Departamentul de Științe Animale, Universitatea din Manitoba, Winnipeg, MB, Canada

Yaw L. Siow

1 Centrul canadian de cercetare agroalimentară în sănătate și medicină, St. Spitalul Boniface Albrechtsen Research Center, Winnipeg, MB, Canada

2 Departamentul de Fiziologie și Fiziopatologie, Universitatea din Manitoba, Winnipeg, MB, Canada

3 Agricultură și Agroalimentare Canada, St. Spitalul Boniface Albrechtsen Research Center, Winnipeg, MB, Canada

Date asociate

Toate seturile de date generate pentru acest studiu sunt incluse în articol/Material suplimentar.

Abstract

Introducere

Boala renală cronică (CKD) este o boală renală frecventă cu un declin progresiv al funcției renale (1). Obezitatea și sindromul metabolic sunt factori de risc independenți pentru dezvoltarea CKD (2). Obezitatea este răspândită în multe țări din întreaga lume. Studii mari de cohortă au arătat că incidența CKD crește cu 20-88% la indivizii obezi (3-5). Există dovezi din ce în ce mai mari că pacienții care au supraviețuit unui traumatism renal acut prezintă riscuri crescute în dezvoltarea CKD (6). CKD a apărut ca o amenințare economică gravă pentru sistemele de îngrijire a sănătății la nivel global datorită prevalenței sale tot mai mari, a complicațiilor (cum ar fi anemia, bolile cardiovasculare, tulburările osoase și minerale), cheltuielile imense asociate terapiei de substituție renală, morbiditatea și mortalitatea ridicată (1).

Fiziopatologia CKD este complexă și este înțeleasă incomplet. Au fost propuse mai multe mecanisme prin care obezitatea provoacă CKD, care includ acumularea de lipide renale, inflamația și disfuncția mitocondrială (5, 7, 8). Răspunsul inflamator cronic a fost implicat ca unul dintre mediatorii importanți care contribuie la leziunile renale la pacienții cu obezitate (9). Un studiu efectuat la pacienți cu insuficiență renală cronică a arătat că leziunile renale au fost corelate pozitiv cu nivelurile de citokine proinflamatorii, și anume, factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α) și interleukina-6 (IL-6) în plasmă (10). S-a raportat că stresul inflamator indus de cazeină a favorizat acumularea de lipide renale și formarea de leziuni glomerulare la șoareci obezi hrăniți cu diete bogate în grăsimi care au prezentat modificări renale și sistemice compatibile cu CKD legată de obezitatea umană (8). Consumul cronic de diete bogate în grăsimi (HFD) contribuie major la dezvoltarea obezității și a anomaliilor metabolice. În studiile noastre anterioare, am observat o creștere a greutății corporale și anomalii metabolice (hiperlipidemie, hiperglicemie) la șoareci hrăniți cu HFD timp de 5-12 săptămâni (11-16). Studii recente au demonstrat leziuni renale la șoarecii obezi induși de dietă, un model murin al CKD (7, 17).

Materiale și metode

Model animal

Cultură de celule

Analiza viabilității celulare

Influența acidului palmitic, a C-3-Glu și a extractului LB asupra viabilității celulelor HK-2 a fost examinată folosind testul bromurii de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium (MTT). Celulele au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri la o densitate de 20.000 de celule/godeu. După 24 de ore de incubație, celulele au fost tratate cu concentrații diferite de acid palmitic, C-3-Glu sau extract de LB pentru încă 24 de ore. MTT tetrazoliu galben (Sigma-Aldrich) a fost adăugat la fiecare godeu pentru a produce o concentrație finală de 100 μM. Supernatantul a fost aspirat 4 ore mai târziu și cristalele de formazan MTT au fost dizolvate în dimetil sulfoxid (DMSO; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Absorbanta la 540 nm a fost citita folosind un cititor de microplaci SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA).

Măsurarea expresiei ARNm

tabelul 1

Exemple de secvențe utilizate pentru RT-qPCR.

Analiza de schimbare a mobilității electroforetice (EMSA)

Kitul LightShift Chemiluminescent EMSA (Thermo Fisher Scientific) a fost utilizat pentru a măsura afinitatea de legare a ADN a NF-κB. Pe scurt, proteinele nucleare au fost extrase din țesuturile șoarecilor de șoarece și din celulele HK-2 așa cum s-a descris anterior (28). Proteinele nucleare (2 μg) au fost incubate într-un amestec de reacție care conține tampon de legare a ADN-ului, poli (dI-dC) și oligonucleotide marcate la capătul biotinei care conțin o secvență consens specifică pentru situsul de legare NF-κB (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCAGGC -3 ′) (Promega, Madison, WI, SUA), conform instrucțiunilor producătorului. Oligonucleotida NF-κB a fost marcată cu biotină la capătul 3 'folosind trusa de marcare a ADN-ului Pierce Biotin 3' End (Thermo Fisher Scientific). După incubare, amestecurile de reacție au fost încărcate într-un gel de poliacrilamidă de 6% care nu denaturează pentru a facilita separarea complexelor ADN-proteine ​​și transferate într-o membrană de nailon (Thermo Fisher Scientific) pentru detectare utilizând kitul modulului de detectare a acidului nucleic chimiluminiscent (Thermo Fisher Scientific).

Imunoblotarea

O alicotă a proteinelor nucleare (10 μg) preparată pentru EMSA a fost supusă analizei imunoblotării occidentale (28, 29). Pe scurt, proteinele nucleare au fost separate prin electroforeză într-un gel SDS-poliacrilamidă de 12% și transferate pe membrane de nitroceluloză (Bio-Rad) utilizând un sistem de transfer turbo-trans (Bio-Rad). Membranele au fost sondate cu anticorp anti-histonică H3 (SC-10809; Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, SUA).

Analiza markerului proinflamator

Nivelurile plasmatice de proteine ​​TNF-α, IL-6 și MCP-1 au fost măsurate folosind un kit U-PLEX Biomarker Group 1 (MesoScale Discovery, Rockville, MD, SUA). Pe scurt, o alicotă de plasmă (25 μl) a fost încărcată într-o placă conținând anticorpi biotinilați pre-acoperiți pentru un marker inflamator specific. Testul a fost efectuat în conformitate cu instrucțiunile producătorului, iar datele cantitative de chimioluminescență au fost obținute folosind QuickPlex SQ 120 (MesoScale Discovery) urmată de analiză utilizând software-ul Discovery Workbench 4.0 (MesoScale Discovery).

Analiza histologică și imunohistochimie

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± eroare standard. Rezultatele au fost analizate folosind ANOVA unidirecțional, urmat de testul de comparație multiplu Newman - Keuls. P Figura 1A). Suplimentarea de lingonberry timp de 12 săptămâni nu a modificat creșterea în greutate corporală indusă de hrănirea cu HFD (Figura 1A). Funcția rinichilor a fost evaluată prin măsurarea nivelurilor de BUN în plasmă, expresia genică a KIM-1, NGAL și renină în rinichi. Hrănirea cu HFD a dus la o creștere semnificativă a nivelurilor de BUN în plasmă (Figura 1B) și la o creștere semnificativă a expresiei mRNA KIM-1, NGAL și renină în rinichi (Figurile 1C - E), indicând că funcția renală a fost afectată. Suplimentarea lingonberry a redus nivelurile plasmatice de BUN, precum și expresia genei renale KIM-1, NGAL și renină (Figura 1). Șoarecii hrăniți cu HFD au avut un nivel mai ridicat de glucoză în sânge decât grupul martor (Figura 2A). Suplimentarea cu lingonberry a redus semnificativ nivelul de glicemie în repaus alimentar la șoarecii hrăniți cu HFD (Figura 2A). A existat, de asemenea, o creștere semnificativă a nivelurilor plasmatice ale trigliceridelor (Figura 2B) și a colesterolului total (Figura 2C) la șoarecii hrăniți cu HFD. Suplimentarea cu lingonberry a redus nivelul trigliceridelor și colesterolului plasmatic la cel similar grupului de control (Figurile 2B, C).

• Proteina chimiotactică monocitară-1 joacă un rol în disfuncția ovariană legată de dieta bogată în grăsimi indusă
• Cacao ingerat poate preveni obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi prin reglarea expresiei genelor pentru
• Identificarea unei bariere care previne progresia tumorilor renale benigne la boala malignă -
• Peptidele Kefir ușurează ateroscleroza indusă de dietă bogată în grăsimi - Healthspan Blog - TruDiagnostic
• JCI - Rolul inextricabil al rinichiului în hipertensiune