Prezentăm aici efectele creșterii grăsimilor dietetice asupra formării și supraviețuirii polipului intestinal în acest model de șoarece de tumoare intestinală spontană.

influențele

MATERIALE ȘI METODE

Înființarea Fondului Imperial de Cercetare a Cancerului (ICRF) MIN C57/BL 6J Colonie.

Șoarecii heterozigoti MIN (C57BL/6JApc Min/+ Apc) au fost inițial obținuți în 1992 (cadou de la A. Moser, McArdle Labs, Universitatea din Wisconsin, Madison). Șoarecii masculi au fost inițial încrucișați înapoi la C57BL/6J de sex feminin (ICRF Biological Resources, Clare Hall, South Mimms, Hertfordshire, Marea Britanie), iar embrionii rezultanți au fost transferați prin histerectomie aseptică pentru mamele asistente în izolatori specifici fără patogeni. Toată reproducerea a fost efectuată ulterior în unități specificate fără patogeni de către împerechere fratele (C57BL/6J-Apc Min/+ Apc) -soră (C57BL/6J).

Genotiparea a fost efectuată printr-o reacție bazată pe PCR utilizând trei primeri incluzând un control intern pentru ADN-ul normal de șoarece, așa cum este descris (15). ADN-ul a fost extras din tăieturile urechii sau cozii la vârsta de 21 de zile. Pe scurt, tăieturile de urechi au fost puse în 20 ml de tampon de liză proaspăt preparat [12,5 μl 1 M Tris (pH 8)/1 μl 5 M NaCI/2,5 μl 10% SDS/25 μl 10 mg/ml proteinază K/250 μl dublu autoclavat -H2O distilat] și amestecat și încălzit într-o baie de 55 ° C timp de 1 oră, amestecat din nou și încălzit timp de încă 2 ore și transferat pe gheață. S-au adăugat optzeci de microlitri de ddH2O și digestul a fiert timp de 15 minute pentru a dezactiva proteinaza K. Apoi, s-au folosit 2,5 pl din acest amestec pentru o PCR de 25 pl. Alternativ, 1 cm de coadă de șoarece fragmentată (obținută sub anestezie) a fost plasată în tampon de liză a cozii (700 μl TENs/35 μl 20% SDS/35 μl de 10 mg/ml proteinază K) și incubată peste noapte la 56 ° C. ADN-ul a fost obținut prin extracția standard de fenol/cloroform cu precipitații de izopropanol și stocat în 250 μl TE. O jumătate de microlitru din acest amestec a fost utilizată pentru un PCR de 25 pl.

Două sute douăzeci și nouă (C57BL/6J-Apc Min/+ Apc) (MIN) și 23 (C57BL/6J- + Apc/+ Apc) (de tip sălbatic) șoareci au fost stratificați aleatoriu prospectiv (de la peste 50 de împerechere) în 3 grupe dietetice după cum urmează:

(i) O dietă „standard” cu un conținut total de grăsimi de aproximativ 3% (Dieta ICRF pentru rozătoare GR3EK.R20, Servicii dietetice speciale, Witham, Essex, Regatul Unit). Conținutul de fibre brute al acestei diete (evaluat prin tehnica de extracție acidă/alcalină) este de 4,1%, iar conținutul de carbohidrați și proteine ​​brute de 58% și respectiv 19,8%.

(ii) O dietă „Grasă” cu un conținut total de grăsimi de minimum 10% [Teklad dieta crescătorului de șoareci (W) 8626; Madison, WI] a obținut din aceeași sursă ca cea utilizată în primele date publicate despre MIN (11). Alți constituenți decât conținutul de grăsimi din această dietă au variat, de asemenea, de la dietele (i) și (iii) prin aceea că conținutul de fibre brute este înjumătățit la 2%, deși proteina brută este similară cu 20%.

(iii) O dietă „bogată în grăsimi” cu un conținut total de grăsimi de aproximativ 15%. Aceasta a fost reconstituită în mod specific prin SDS de la 85% din greutatea dietei standard ICRF pentru rozătoare GR3EK.R20 (adică, ca dietă și mai mult), cu un ulei de porumb suplimentar de 15% din greutate. Cei patru constituenți principali ai acizilor grași ai uleiului de porumb folosit sunt: ​​42,9% linoleic, 23,4% oleic, 9,8% palmitic și 2% steric.

Dietele standard (i) și bogate în grăsimi (iii) sunt, prin urmare, similare, în afară de conținutul total de grăsimi, în timp ce dieta (ii) Grăsimea diferă în grăsimi și are o compoziție mai mică de fibre. Gama de diete a fost selectată parțial pentru a contribui la numărul de polipi substanțial mai scăzut și la creșterea supraviețuirii pe care am observat-o inițial la șoarecii ICRF MIN, comparativ cu datele publicate inițial din care proveneau șoarecii noștri MIN (11).

Dietele au fost alocate aleatoriu și au fost inițiate ad libitum de la înțărcare la vârsta de aproximativ 21 de zile, după transferul lor către izolatoare dedicate găzduite într-o unitate separată „deschisă” (adică, în condiții normale de laborator pentru animale fără patogeni nespecificați). Nu s-a făcut nicio încercare de ajustare pentru valorile dietetice calorice, deoarece aportul și utilizarea calorifică la șoareci nu sunt ușor de controlat sau de evaluat și se agravează în continuare de diferențele potențiale în gustul dintre cele trei diete. Au fost raportate, de asemenea, manipularea alimentară anormală, inclusiv rezistența la obezitate la șoarecii de laborator C57BL pentru care baza nu este clară (16). Șoarecii au fost totuși cântăriți în grupurile lor stratificate săptămânal, de la înțărcare până la sacrificiu. Șoarecii C57BL/6J- + Apc/+ Apc din fiecare sex au fost, de asemenea, alocați aleatoriu ca martori negativi în cadrul fiecărui grup dietetic pentru a exclude posibilele efecte adverse neașteptate și, de asemenea, ca martori pozitivi pentru comparațiile de greutate. Acest lucru a fost pentru a ne asigura că observațiile noastre nu au fost confundate cu efecte dăunătoare independente de fenotipul MIN sau, invers, de manipulare dietetică anormală care ar putea fi dependentă de MIN.

Nevoia de sacrificiu a fost determinată de tehnicieni independenți care au evaluat șoarecii zilnic. Mortalitatea MIN se datorează de obicei anemiei progresive severe, prolapsului rectal sau obstrucției intestinale. Progresia unei tumori mamare la peste 1 cm în diametru necesită, de asemenea, sacrificiu. Când a fost posibil, post-mortemurile, numărarea și măsurătorile au fost efectuate cu o singură orb de către o singură persoană (H.S.W.), în caz contrar măsurătorile tumorale au fost ignorate. La post mortems intestinul a fost izolat, disecat longitudinal, spălat de trei ori în PBS și răspândit pe hârtie 3MM. Intestinul subțire a fost împărțit în trei secțiuni aproximativ egale [proximal (SB1), mijlociu (SB2) și distal (SB3)]. O evaluare a numărului vizibil, a mărimii [media celor două diametre cele mai mari cu etriere digitale (Micron Sales, Londra)] și a distribuției tumorilor intestinale a fost făcută apoi la un microscop de disecție × 10. Acuratețea rezoluției dimensiunii tumorii prin această abordare a necesitat numărarea pe interval de 1 mm. Secțiunile au fost apoi fixate în soluție salină formală de 9% și încorporate în parafină pentru evaluare histologică. Toate procedurile sunt aprobate de comitetul de etică a animalelor ICRF.

Analize statistice.

Datele au fost introduse în Microsoft Excel 5.0 și ulterior analizate folosind stata 4.0 (Timberlake, Kent, Regatul Unit). Comparațiile supraviețuirii în funcție de dietă au folosit analize Kaplan - Meier și log-rank și au fost specifice cauzei (fără a include șoarecii sacrificați pentru tumorile mamare). Numerele tumorale au fost comparate cu testul de sumă de rang al lui Wilcoxon. Pentru dimensiunea tumorii, proporția tumorilor cu un diametru mai mare de 3 mm a fost comparată prin testul Pearson χ 2.

REZULTATE

(a) Numărul polipilor intestinului gros și (b) la șoarecii MIN (C57BL/6J- Min/+ Apc) pe trei diete diferite, care variază în compoziția lor grasă. Comparații prin testele de sumă de rang ale lui Wilcoxon.

(a) Curbele de supraviețuire Kaplan - Meier ale MIN (C57BL/6J- Min/+ Apc) pe trei diete diferite, variind în compoziția lor grasă. (b) Efectul asupra curbelor atunci când opt animale sunt excluse („valori aberante” prin analiza reziduală). Rețineți că cinci dintre acești șoareci provin de la un părinte.

Tabel rezumativ al datelor colective prezentate în text și cifre

(a - c) Numărul de polipi intestinali mici (simboluri solide) și mari (simboluri deschise) la șoareci MIN (C57BL/6J- Min/+ Apc) vs. vârsta pe cele trei diete diferite cu linii de regresie logistică cele mai potrivite. (d) Comparații de regresie logaritmică între cele trei diete diferite din datele individuale din a - c (adică, trei grafice suprapuse).

Deoarece dietele nu erau izocalorifice, greutățile medii săptămânale ale unui eșantion din fiecare grup de șoareci sunt prezentate în Fig. 4. Ponderile medii globale între grupurile de grăsimi dietetice de 3%, 10% și 15% nu au fost semnificativ diferite de-a lungul duratei lor de viață sau după cum au fost evaluate prin greutățile maxime atinse (datele nu sunt prezentate). O tendință de divergență este evidentă după vârsta de aproximativ 15 săptămâni, dar este confundată de o scădere treptată a greutăților de la aproximativ 24 de săptămâni din cauza morbidității dependente de MIN și a variației mai mari, deoarece numărul șoarecilor evaluabili a scăzut progresiv. Modelele de greutate ale grupurilor echivalente ale controalelor C57BL/6J- + Apc/+ Apc au fost din nou similare până la aproximativ 20 de săptămâni (datele nu sunt prezentate), demonstrând că Apc nu este probabil implicat direct în absorbția intestinală sau în metabolism.

Greutatea medie a șoarecilor MIN (C57BL/6J- Min/+ Apc) stratificați în funcție de sex pe cele trei diete diferite, variind în compoziția lor grasă. Greutățile sunt reprezentate grafic la intervale de cinci săptămâni de la înțărcare (de la vârsta de weeks3 săptămâni).

Histologie.

În afară de mărime, nu s-au găsit diferențe evidente între grupurile dietetice, fie în aspectul macro sau microscopic pe secțiunile de hematoxilină/eozină ale polipilor intestinului subțire sau gros. Invazia locală în lamina propria este rară în MIN, dar apare mai frecvent în polipii mai mari și nu a fost observată în tumorile cu diametrul mai mic de 3 mm. Nu s-a observat nicio creștere evidentă a tumorilor invazive cu grăsimi dietetice mai ridicate. Nu au fost observate metastaze microscopice la ganglionii limfatici mezenterici, ficat sau plămân într-o probă aleatorie de șoareci.

Tumorile mamare și dieta.

Douăzeci și șapte de tumori mamare au apărut la 93 de femele în total (29%). Nu s-a observat o creștere a tumorilor mamare la 15% grăsimi (26,5%) comparativ cu dieta de 3% grăsimi (41,3%, 9 tumori la 34 de femei, față de 12 tumori la 29 de femei). Deși au existat doar 6 tumori la 30 de femele (20%) în grupul cu 10% grăsime, această incidență nu a fost semnificativ diferită de celelalte două grupuri de Pearson by 2. Vârsta medie a sacrificiului specific tumorii mamare a fost semnificativ mai mică decât supraviețuirea generală a grupului (vezi Tabelul 1), dar a fost din nou independentă de dietă. Sacrificiile datorate apariției imprevizibile a polipilor rectali prolapsate au fost, de asemenea, independente de dietă și nu au avut nicio influență asupra vreunui obiectiv final (datele nu sunt prezentate).

DISCUŢIE

Supraviețuirea primilor 100 de șoareci C57BL/6J MIN la ICRF a fost semnificativ mai lungă, în mod corespunzător mai puțini polipi de intestin mic și gros în comparație cu datele publicate inițial [223 ± 43 zile, medie ± SD (ICRF-MIN) vs. 119 ± 31 de zile] (11) de unde au provenit direct șoarecii MIN. Acest lucru a sugerat că pot exista factori puternici de modificare a mediului care influențează inițierea și dezvoltarea tumorii în modelul de șoarece MIN. Prin urmare, ne-am propus să investigăm într-un studiu controlat randomizat monocec unele dintre posibilele motive ale diferențelor marcante aparente prin modificarea conținutului de grăsimi din dietă la șoarecii noștri MIN și, de asemenea, reinstituind aceeași dietă care a fost utilizată în publicația originală.

Rezultatele noastre sugerează că dieta singură nu poate explica diferențele relativ mari observate între numărul mic de tumori și datele publicate inițial (11). Este posibil ca diferențele de tulpină dintre colonii să fie parțial responsabile, în ciuda etichetei lor C57BL/6J. Într-adevăr, variația intrastrain este sugerată de Fig. 2b, deoarece cinci dintre cele opt valori anterioare erau legate. Pe de altă parte, nu am observat nicio modificare semnificativă a numărului de tumori de-a lungul timpului cu șoarecii ICRF MIN, care erau originari din Wisconsin. Mai exact, nu a existat o scădere rapidă a numărului de tumori cu primele generații, așa cum ar fi de așteptat dacă diferențele de tulpină erau în mare parte responsabile (observații personale). O altă posibilă explicație este că dieta este doar o parte a ecuației și că microflora intestinală, despre care se știe că joacă un rol semnificativ în interacțiunea cu constituenții dietetici, joacă un rol critic în influențarea micro-mediului tumoral. Am observat deja schimbări semnificative în acest sens în propriile noastre colonii MIN găzduite în instalații cu diferite stringențe pentru evitarea microbiană.

Majoritatea studiilor efectuate pe animale până în prezent s-au concentrat pe modele de carcinogeneză a rozătoarelor. C57BL/6J este o tulpină de șoarece relativ rezistentă la inducerea adenocarcinoamelor colonice de către DMH (20). În schimb, este o tulpină foarte sensibilă la dezvoltarea tumorii cu Min/+ Apc (15, 21). Temple și El-Katib au arătat că o dietă bogată în grăsimi a acționat ca factor de promovare atunci când a fost administrată după ce tratamentul cu DMH a fost oprit, dar dacă a fost administrat simultan cu administrarea de DMH, a crescut doar ușor incidența tumorilor de colon (8). În mod surprinzător, 3 din cei 36 șoareci C57BL/1 care au alimentat o dietă suplimentată doar cu ulei de porumb și acid oleic au dezvoltat carcinoame cu metastaze, în mod normal, un eveniment foarte rar la șoareci (22). Suplimentele noastre bogate în grăsimi s-au bazat și pe ulei de porumb, dar nu am observat metastaze în populația noastră de studiu. Problema cu studiile cancerigene, așa cum am discutat mai devreme, este că relația dintre aportul de grăsime și animalele experimentale rămâne contradictorie și controversată (17). Deși un studiu prospectiv la asistenți medicali a arătat un risc semnificativ pentru grăsimea alimentară după ajustarea aportului caloric total (23), nu a fost întotdeauna confirmat un rol cauzal în alte studii experimentale și de control al cazurilor umane (24) și chiar a demonstrat o asociere inversă (25-27).

Datele noastre sugerează că tumorile pot fi inițiate prin creșterea grăsimilor alimentare. Studiile de cancerigeneză din MIN arată că perioada cea mai probabilă să influențeze dezvoltarea tumorii este înainte de primele 3 săptămâni de viață. După 3 săptămâni, se poate observa o influență mai slabă asupra inițierii polipului (33). Dietele noastre au fost inițiate după înțărcare și, prin urmare, aceasta nu poate fi și perioada critică pentru influența lor. Cu toate acestea, deoarece metoda noastră nu detectează tumorile cărora li se adresează cererile de reimprimare. e-mail: walter.bodmerhertford.ox.ac.uk .

Walter F. Bodmer

Meeting Reuniunea Keystone a Asociației Americane de Cercetare a Cancerului, februarie 1996, 1996, A52, abstr.