rezumat

Adipocitele există în depozite discrete și au roluri diverse în cadrul micro-mediului lor unic. Deoarece diferențele regionale în caracterul și funcția adipocitelor sunt descoperite, identificarea standardizată și izolarea depozitelor sunt cruciale pentru avansarea câmpului. Aici, vă prezentăm un protocol detaliat pentru excizia diferitelor depozite adipoase de șoarece.

Abstract

Țesuturile adipoase sunt organe complexe cu o gamă largă de funcții, inclusiv stocarea și mobilizarea energiei ca răspuns la nevoile locale și globale, decuplarea metabolismului pentru a genera căldură și secreția de adipokine pentru a regla homeostazia întregului corp și răspunsurile imune. Cercetările emergente identifică diferențe regionale importante în profilurile de dezvoltare, moleculare și funcționale ale adipocitelor situate în depozite discrete din tot corpul. Diferitele proprietăți ale depozitelor sunt relevante din punct de vedere medical, deoarece bolile metabolice demonstrează adesea efecte specifice depozitului. Acest protocol va oferi investigatorilor un atlas anatomic detaliat și un ghid de disecție pentru identificarea reproductibilă și precisă și excizia diverselor țesuturi adipoase de șoarece. Disecția standardizată a depozitelor adipoase discrete va permite comparații detaliate ale caracteristicilor lor moleculare și metabolice și contribuțiile la condițiile patologice locale și sistemice în diferite condiții nutriționale și de mediu.

Introducere

În plus față de localizarea lor în marile depozite WAT și BAT, adipocitele există în nișe discrete din tot corpul 4, unde pot îndeplini funcții specializate în cadrul micro-mediului lor respectiv. De exemplu, țesutul adipos al măduvei osoase (BMAT) servește ca rezervor de lipide, este o sursă majoră de adiponectină circulantă și interacționează îndeaproape cu osteoblastele, osteoclastele și celulele hematopoietice 10, 11. Adipocitele cutanate contribuie la procesele pe scară largă, inclusiv vindecarea rănilor, răspunsul imun, termoreglarea și creșterea foliculilor de păr 12, 13. În plus, adipocitele epicardice pot produce mai multe adipokine și chemokine care exercită efecte locale și sistemice asupra dezvoltării și progresiei bolii coronariene 14. Extinderea WAT ​​inter/intramusculară a fost corelată pozitiv cu adipozitatea crescută, rezistența sistemică la insulină și scăderea forței și mobilității musculare 15. În plus, adipocitele poplitee servesc ca rezervor de lipide pentru expansiunea limfatică în timpul infecției 16. În timp ce rolurile specifice ale diferitelor depozite articulare sunt în general necunoscute, depozitul Hoffa (infrapatelar) din interiorul genunchiului este acum considerat a contribui la patologii, incluzând durerea anterioară a genunchiului și osteoartrita 17 .

În timp ce diferențele regionale în caracterul și funcția adipocitelor sunt în curs de studiu intens, domeniul este în prezent limitat de lipsa unui protocol standardizat pentru identificarea și disecția diverselor depozite de șoareci. Metodele publicate anterior au descris de obicei izolarea unuia sau a două depozite specifice și nu au nivelul de detaliu necesar pentru excizia uniformă 18, 19. Protocolul descris în acest manuscris oferă un ghid cuprinzător pentru locațiile anatomice specifice și pașii de izolare a multor depozite diferite de adipos de șoarece. Deși depozitele WAT sunt centrul principal al acestui manuscris, excizia BAT interscapulară este, de asemenea, descrisă în detaliu. Țesuturile adipoase excizate utilizând acest protocol pot fi utilizate pentru o mare varietate de obiective experimentale, inclusiv studii de explant, histologie și analize ale expresiei genelor.

Scopul acestui manuscris este de a oferi anchetatorilor un protocol detaliat pentru a identifica în mod clar și precis și a izola atât depozitele proeminente, cât și cele mai puțin studiate, de adipos de șoarece (figura 1). Această resursă va facilita o investigație mai completă a caracteristicilor de dezvoltare, moleculare și funcționale ale adipocitelor în diverse nișe.

diverselor

Figura 1: Reprezentarea schematică a depozitelor adipoase de șoarece disecate în acest protocol. Această imagine a fost adaptată din Bagchi și colab., 2018 4. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate procedurile la animale sunt efectuate cu aprobarea Comitetului instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) din cadrul Universității din Michigan.

NOTĂ: În scopul acestui protocol video, se folosesc șoareci C57BL/6J de 4-6 luni.

  1. Așezați mouse-ul într-o cameră de vaporizare cu izofluran și reglați debitul de izofluran la 5% sau mai mare. Continuați expunerea la izofluran până la un minut după oprirea respirației. Apoi scoateți mouse-ul din camera vaporizatorului și confirmați eutanasia folosind o măsură secundară aprobată.
    NOTĂ: Măsurile secundare aprobate vor varia în funcție de instituție și de protocolul animalului și pot include luxația cervicală sau decapitarea.
  2. Așezați mouse-ul eutanasiat pe tava de disecție. Sterilizați suprafețele exterioare dorsale și ventrale ale mouse-ului folosind 70% etanol. Asigurați-vă că suprafața externă a mouse-ului este suficient de umedă pentru a reduce la minimum contaminarea din blană în timpul disecției.

2. Identificarea și izolarea țesuturilor adipoase majore subcutanate (subcutanat anterior, dorsolombar, inghinal, gluteal) și a țesutului adipos maro interscapular

3. Identificarea și izolarea depozitelor adipoase viscerale (gonadale, perirenale, retroperitoneale, Omentale, pericardice)

4. Identificarea și izolarea altor depozite adipoase

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Identificarea și izolarea cu succes a diferitelor depozite adipoase de șoarece pot fi realizate utilizând protocolul descris mai sus. Locațiile anatomice brute ale depozitelor subcutanate (A, E-F), maro (B), visceral (C, D, G-J) și poplitee (K) sunt prezentate în Figura 2.


Figura 2: Locații anatomice brute ale depozitelor adipoase de șoarece. Anatomia brută a (A) subcutanat anterior, (B) maro, (C) epididim (b, vezică urinară), (D) ovarian (u, coarne uterine), (E) subcutanat posterior (dorsolombar (d), inghinal (i), gluteal (g)), (F) inghinal, (G) mezenteric, (H) perirenal (k, rinichi), (Eu) retroperitoneal (k, rinichi), (.) pericardic (h, inimă) șiK) depozite adipoase poplitee la șoareci adulți C57BL/6J. Săgețile indică depozite specifice dacă sunt prezentate mai multe depozite. Organele relevante sunt desemnate prin litere corespunzătoare. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

Caracteristicile histologice ale depozitelor de adipos subcutanat (AD), maro (E), visceral (FK), popliteu (L), constitutiv (M) și măduvei reglementate (N), intramusculare (O) și infrapatelare (P) au fost evaluate Colorarea hematoxilinei și a eozinei (H&E) 22 și sunt prezentate în figura 3.


Figura 3: Evaluarea histologică a depozitelor adipoase de șoareci discrete. Histologia (A) subcutanat anterior, (B) dorsolombar, (C) inghinal, (D) gluteal, (E) maro, (F) gonadal, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (Eu) omental, (.) mezenteric, (K) pericardic, (L) popliteu, (M) constitutiv și (N) adipos de măduvă osoasă reglementat, (Oh) intermuscular și (P) depozite infrapatelare la șoareci adulți C57BL/6J. Țesuturile au fost izolate în conformitate cu protocolul dat, fixate peste noapte în 10% formalină tamponată neutră, prelucrate și încorporate în parafină. 5 secțiuni m secțiuni au fost colorate cu H&E. Majoritatea imaginilor au fost realizate la o mărire de 100x; Bara de scalare = 100 µm. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Deoarece importanța diverselor caracteristici moleculare și funcționale ale clusterelor discrete de adipocite este recunoscută din ce în ce mai mult, este crucial ca anchetatorii din domeniu să identifice și să accizeze în mod uniform depozitele de grăsime pentru analize ulterioare. Până în prezent, există puține protocoale pentru localizarea și izolarea standardizate a gamei largi de depozite adipoase de șoarece. Metodele publicate anterior se concentrează în principal pe unul sau două depozite și nu au detaliile necesare pentru identificarea uniformă și excizia de către diferiți anchetatori 18, 19. Acest manuscris este o contribuție nouă și importantă la domeniul biologiei adipoase, deoarece oferă un ghid aprofundat pentru localizarea anatomică și disecția precisă a depozitelor studiate în mod obișnuit și mai puțin cunoscute de-a lungul mouse-ului. Localizarea anatomică brută și analizele histologice sunt furnizate pentru a demonstra diversitatea nișelor adipocitare.

Izolarea cu succes a depozitelor adipoase discrete folosind acest protocol depinde de mai mulți pași critici. Întreținerea unui mediu curat de disecție este crucială; 70% etanol poate fi utilizat după cum este necesar pentru a îndepărta firele de păr sau sângele contaminant din tava de disecție și din unelte. Când se izolează WAT subcutanat posterior, este imperativ ca incizia inițială a pielii să nu pătrundă în cavitatea peritoneală strâns asociată, astfel încât cele două straturi să poată fi separate eficient pentru a expune WAT. În mod similar, atunci când tăiați peretele peritoneal pentru a expune conținutul cavității abdominale, inciziile nu trebuie să perforeze intestinele subiacente pentru a preveni contaminarea cu elemente digestive. BAT interscapulară trebuie eliminată cu atenție din țesutul înconjurător pentru a preveni contaminarea WAT, ceea ce va distorsiona analizele viitoare. Identificarea consecventă a depozitelor dorsolombare, inghinale și gluteale posterioare subcutanate depinde de utilizarea reperelor anatomice precise descrise în protocol. Distincția dintre aceste depozite este deosebit de importantă; deși depozitele pot părea a fi continue, adipocitele inghinale situate central dobândesc caracteristici asemănătoare maro mai ușor decât omologii lor din jur.

Țesuturile adipoase izolate folosind acest protocol pot fi analizate folosind o varietate de tehnici. În plus față de evaluarea histologică (de exemplu, colorarea H&E, imunohistochimia), țesuturile adipoase pot fi utilizate pentru o gamă largă de analize moleculare, de la reglarea transcripției până la modificările de proteine ​​posttranslaționale. Adipocitele și celulele vasculare stromale din depozitele individuale pot fi izolate prin digestie colagenază și centrifugare diferențială. Aceste fracțiuni pot fi apoi utilizate pentru studii moleculare, metabolice și de cultură celulară. Explanele de depozit pot fi, de asemenea, utilizate pentru teste metabolice și enzimatice ex vivo.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.