Bin Jiang

1 Departamentul de ginecologie, al treilea spital Xiangya al Universității Centrale de Sud, Changsha China,

reglare

Min Xue

1 Departamentul de ginecologie, al treilea spital Xiangya al Universității Centrale de Sud, Changsha China,

Dabao Xu

1 Departamentul de Ginecologie, Al Treilea Spital Xiangya al Universității Centrale de Sud, Changsha China,

Jiayu Song

1 Departamentul de Ginecologie, Al Treilea Spital Xiangya al Universității Centrale de Sud, Changsha China,

Shujuan Zhu

1 Departamentul de ginecologie, al treilea spital Xiangya al Universității Centrale de Sud, Changsha China,

Abstract

1. INTRODUCERE

Sindromul ovarului polichistic (SOP) este cea mai frecventă tulburare endocrină la femei în timpul vârstei reproductive, care este asociată cu hiperinsulinemie, hiperandrogenemie și producție aberantă de adipokine din țesutul adipos. calitatea vieții pacienților.2 Incidența SOP este de 6% -10% conform criteriilor Institutului Național de Sănătate, care atinge 15% pe baza criteriilor mai largi de la Rotterdam. 3 SOP se caracterizează prin creșterea stromei ovariene și a foliculilor antrali, în în plus față de îngroșarea corticală ovariană și hiperplazia celulelor theca.4 Femeile cu SOP sunt extrem de vulnerabile la anovulație și infertilitate și chiar și acești factori de risc (obezitate, sângerări uterine anormale și diabet) contribuind la dezvoltarea cancerului endometrial.5 Studii multiple au furnizat dovezi pentru rolul țintelor moleculare în tratamentul SOP, care includ ARN-uri lungi necodificate (ARNc), m icroARN (miARN) și genele țintă corespunzătoare.6, 7, 8

2. MATERIALE ȘI METODE

2.1. Animale experimentale

2.2. Stabilirea modelului și identificarea SOP

De la vârsta de 23 de zile, șobolanii PCOS au fost injectați subcutanat cu sulfat de dehidroepiandrosteron (DHEA) și sulfat de prasteronă de sodiu (9 mg/100 g greutate corporală) și 0,4 ml apă pentru injecție, care a durat 20 de zile. Șobolanii din grupul normal au fost injectați cu 0,4 ml de apă pentru injecție în același moment în fiecare zi. La 20 de zile mai târziu, șobolanii au fost lipsiți de hrană timp de 12 ore. Apoi ovarele au fost extrase. Prin frotiul vaginal s-a determinat ciclul estru. Nivelurile hormonale serice, colorarea hematoxilinei-eozinei (HE), microscopul electronic de transmisie (TEM) și testul terminal de marcare a deoxinucleotidil transferazei (TUNEL) au fost adoptate pentru identificarea modelelor. Când modelele au fost determinate ca având succes, șobolanii fiecărui grup au fost tratați în mod corespunzător a doua zi, iar injecția continuă a durat 7 zile.

2.3. Test imunosorbent legat de enzime (ELISA)

Șobolanii din toate grupurile au fost lipsiți de hrană, dar nu de apă după ultima injecție. După recoltarea de sânge din inimă, serul a fost izolat. ELISA a fost utilizat pentru a determina nivelurile serice de hormon foliculostimulant (FSH), hormon luteinizant (LH), teststeronă (T) și estradiol (E2) (Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng, Nanjing, Jiangsu, China). Șobolanii au fost eutanasiați prin dislocare cervicală, cu ambele ovare extrase. S-au observat morfologia și culoarea ovarelor. Greutatea a fost măsurată și înregistrată.

2.4. Colorarea hematoxilinei și a eozinei

O parte a ovarului a fost pregătită și fixată în 10% formaldehidă pentru mai mult de 24 de ore. Apoi ovarul a fost deshidratat în etanol cu ​​gradient, permeabilizat de xilen și încorporat în parafină după scufundare în ceară. Ovarul a fost tăiat în secțiuni cu o grosime de 4 μm. Ulterior, secțiunile au fost depilate și hidratate, urmate de colorarea HE. După tratamentul gradientului de etanol, secțiunile colorate au fost permeabilizate cu xilen și montate în balsam neutru. Structurile morfologice ale foliculilor ovarieni au fost observate la microscopul cu lumină.

2.5. Microscop electronic cu transmisie (TEM) pentru a observa ultrastructura foliculilor ovarieni

O parte a ovarului a fost preparată și fixată în glutaraldehidă 2% timp de 24 de ore, urmată de felierea în blocuri (1 mm 3). Blocurile ovariene au fost scufundate peste noapte după clătiri repetate cu 0,1 mol/L soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Apoi blocurile au fost fixate în acid osmic 1% la 4 ° C timp de 2 ore, urmate de spălare cu apă deionizată de trei ori (5 min pe spălare). La 4 ° C, blocurile ovariene au fost deshidratate în gradină de acetonă și încorporate, urmate de polimerizare la 70 ° C timp de 36 de ore. Apoi, blocurile au fost tăiate în secțiuni semi-subțiri, care au fost colorate cu azur - albastru de metilen și localizate la microscopul luminos. Apoi, secțiunile au fost realizate în secțiuni ultra subțiri, tratate cu o pată dublă de electroni de acetat de uranil - citrat de plumb. În cadrul TEM, au fost observate și fotografiate ultrastructurile celulelor granuloase ovariene, ale celulelor theca și ale celulelor luteinice.

2.6. Analiza TUNEL

Țesuturile ovariene încorporate în parafină au fost colectate pentru colorarea TUNEL. A fost calculat numărul de celule apoptotice din câmpul de vizualizare (× 200). Au fost numărate zece câmpuri și au fost înregistrate celule apoptotice în fiecare câmp. Particulele maronii reprezentau celule pozitive. Indicele apoptotic (AI) = (numărul de celule apoptotice/numărul total de celule) × 100%.

2.7. Separarea și cultura celulelor granuloase ovariene

Țesuturile ovariene ale șobolanilor PCOS au fost colectate și imersate imediat în ser fiziologic normal. La microscop, capsula ovarelor și țesuturile adipoase din jur au fost îndepărtate. S-a utilizat din nou soluție salină normală pentru a clăti eritrocitele la suprafață. Țesuturile ovariene au fost plasate în mediul DMEM/F12 fără ser (Gibco, Grand Island, NY, SUA), unde foliculii au fost străpunși pentru a elibera celule granuloase ovariene. Apoi, celulele granuloase ovariene au fost ușor triturate pentru a suspenda celulele unice, care au fost filtrate printr-un ecran de 200 ochiuri și centrifugate la 1000 rpm timp de 8 minute cu supernatantul aruncat și recoltat celule. Celulele granuloase ovariene depuse au fost adăugate cu mediu DMEM/F12 suplimentat cu 15% ser fetal bovin (FBS) (Gibco, Grand Island) pentru incubare într-un incubator cu 5% CO2 la 37 ° C. Mediul a fost înlocuit 24 de ore mai târziu, când celulele au aderat la perete. După ce celulele aderente au fost îndepărtate, amestecul a fost incubat în continuare. Când confluența celulară a atins 80%, celulele au fost desprinse și celulele au fost recoltate după centrifugare. Celulele granuloase depuse au fost adăugate cu mediu DMEM/F12 și triturate pentru a prepara suspensia celulară, care au fost colorate cu albastru de tripan. Celulele au fost numărate la microscop și apoi subculturate.

2.8. Gruparea și tratamentul celular

Celulele granuloase ovariene în faza de creștere logaritmică au fost grupate după cum urmează: grup gol (fără niciun tratament), grup EP (transfectat cu plasmidă goală), grupul si - HOTAIR (transfectat cu plasmidă ARNs împotriva HOTAIR), oe - grup HOTAIR (transfectat cu plasmida de supraexpresie a HOTAIR), grupul NC (transfectat cu NC de miR - 130a) și grupul mimic miR - 130a (transfectat cu mimic miR - 130a). Conform instrucțiunilor lipofectaminei 2000 (Invitrogen), celulele au fost transfectate și incubate în incubatoare timp de 48 de ore, urmate de experimentele ulterioare.

2.9. Testul genei reporter dual-luciferază

Siturile de legare ale lncRNA HOTAIR și miR-130a au fost prezise de site-ul web bioinformatică (https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/). Apoi, relația de legare dintre lncRNA HOTAIR și miR-130a a fost confirmată prin utilizarea testului genei raportor dual-luciferază. Fragmentele de gene sintetizate de miR - 130a 3’UTR au fost inserate în pMIR - REPORT ™ miRNA Expression Reporter Vector System (AM5795; Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, SUA) prin site-uri de endonuclează precum SpeI și Hind III. Siturile de mutație complementare au fost proiectate pe tipul sălbatic (WT) miR - 130a. Prin T4 ADN ligază, fragmentele țintă (secvența WT și secvența MUT) au fost inserate în pMIR - REPORT ™ miRNA Expression Reporter Vector System după scindarea endonucleazei de restricție. Plasmida raportor luciferază dreaptă WT și MUT după secvențiere au fost cotransfectate în celulele granuloase ovariene. După 48 de ore de transfecție, celulele 293T au fost recoltate și lizate. Activitatea luciferazei a fost evaluată printr-un kit de testare a genei reporter dual-luciferază (Biovision) și un luminometru Glomax20/20 (Promega, Madison, WI, SUA). Experimentul a fost realizat de trei ori.

Site-ul bioinformatică (http://www.targetscan.org) a fost căutat pentru a prezice relația de direcționare dintre miR-130a și IGF1, precum și site-urile de legare ale miR-130a și IGF1 mRNA 3’UTR. Secvența regiunii promotorului ARNm 3’UTR IGF1 conținând situsuri de legare miR-130a au fost sintetizate și a fost construită plasmida IGF1 3’UTR-WT. Pe baza plasmidei IGF1 3'UTR - WT, locurile de legare au fost mutate pentru a construi plasmida IGF1 3'UTR - MUT, iar plasmida vectorială a plasmidei IGF1 3'UTR - WT și a plasmidei IGF1 3'UTR - MUT au fost construite de pMIR ‐REPORT ™ miRNA Expression Reporter Vector System (AM5795; Thermo Fisher Scientific). Experimentul a fost realizat conform instrucțiunilor din trusa de extracție a plasmidelor (Promega). Celulele în creștere logaritmică au fost însămânțate în placa cu 96 de godeuri. Când confluența celulară a ajuns la 70%, celulele au fost transfectate conform instrucțiunilor lipofectaminei 2000. Plasmida IGF1 3’UTR - WT și plasmida mimică miR - 130a au fost amestecate și transfectate în celulele granuloase ovariene. IGF1‐3’UTR - WT + NC și IGF1‐3’UTR - MUT + NC au fost, respectiv, cotransfectate cu mimică IGF1‐3’UTR - MUT + miR - 130a. După transfecție de 48 de ore, celulele au fost recoltate și lizate. Activitatea luciferazei a fost detectată prin utilizarea unui kit de testare a genei raportor dual-luciferază. Experimentul a fost realizat de trei ori.

2.10. ARN - trageți în jos

Celulele au fost transfectate cu miR-130a biotinilat WT și respectiv miR-130a biotinilat MUT (50 nmol/L pentru fiecare), respectiv. După transfecție de 48 de ore, celulele au fost recoltate și spălate cu PBS și incubate timp de 10 minute în lizat celular specific (Ambion). Lizatul celular eșantion a fost colectat separat (50 ml). Liza reziduală a fost incubată cu margele magnetice M-280 streptavidină (Sigma, St. Louis, MO) acoperite cu ARN-free și drojdie ARNt (Sigma) timp de 3 ore la 4 ° C. După spălare în lizat rece ca gheața de două ori, celulele au fost clătite în tampon cu conținut scăzut de sare de trei ori și în tampon cu conținut ridicat de sare o dată. Antagonistul sondei miR-130a a fost stabilit ca un NC. A fost adoptată metoda Trizol pentru extragerea ARN-ului total. Expresia lncARN HOTAIR a fost determinată prin transcripție inversă - reacție în lanț cantitativă a polimerazei (RT - qPCR).

2.11. Izolarea și cuantificarea ARN-ului