Abstract

grelina este singurul hormon gastrointestinal stimulator al apetitului cunoscut la om și la alte vertebrate. Administrarea exogenă a acestei peptide de 28 aminoacizi crește foamea pe termen scurt, aportul de alimente și motivația de a mânca, precum și greutatea corporală (14, 16, 17, 67). Nivelurile de grelină circulante se corelează cu echilibrul energetic, adică cresc odată cu pierderea în greutate sau în timpul anticipării mesei și scad odată cu creșterea în greutate sau după consumul de alimente. Efectele orexigenice ale lui Ghrelin dau o importanță practică înțelegerii detaliate a reglării sale prin dietă.

Prezentele studii au fost întreprinse pentru a evalua dacă hiperosmolaritatea intestinului subțire (așa cum apare după ingestia mesei) afectează nivelurile de grelină și ar putea explica parțial suprimarea diferențială a grelinei de către diferite tipuri de alimente. Acest efort a fost determinat parțial de observația noastră anterioară că perfuziile de lipide intestinale suprimă slab grelina și au o osmolaritate scăzută, în timp ce carbohidrații izocalorici/izovolumici, dar hiperosmolari sau aminoacizii sunt puternici supresori ai grelinei (69). Mai mult, o literatură considerabilă, veche de zeci de ani, raportează multiple efecte ale alimentelor hiperosmolare care sunt compatibile teoretic cu nivelurile de grelină suprimate, adică inhibarea golirii gastrice, scăderea consumului de alimente și creșterea ratei metabolice (11, 19, 21, 29, 36, 38, 39, 66, 89).

Hiperosmolaritatea intestinului subțire, care însoțește în mod natural digestia alimentelor, reflectă prezența intestinală a constituenților solari în apă, neabsorbiți, inclusiv săruri, substanțe nutritive și fibre solubile (33). La ieșirea din stomac, chimul poate avea o osmolaritate mai mare decât cea a fluidelor și țesuturilor corpului înconjurător, care sunt în general menținute la ~ 285 mosmol/l în sânge și fluide interstițiale și în intervalul 400-700 mosmol/l în vilozitățile intestinului subțire ( 34). Deși mecanismele compensatorii operează pentru a restabili echilibrul osmotic între chimul intestinal hiperosmolar și împrejurimile sale (24), diferite mese mixte și agenți hipertonici sunt capabili să inducă un mediu hiperosmolar mai susținut în lumenul gastric și intestinal (5, 25, 37, 39, 43, 48, 66, 82, 83).

MATERIALE ȘI METODE

Animale.

Experimentele au fost efectuate pe șobolani Sprague-Dawley masculi (ATL, Kent, WA), cu vârsta cuprinsă între 16-25 săptămâni și cântărind 300-450 g. Animalele au fost adăpostite în mod individual la sistemul de îngrijire a sănătății Puget Sound al Veteranilor (VAPSHCS), Divizia Seattle, o unitate acreditată AAALAC. Șobolanii au avut acces ad libitum la chow granulat și apă între sesiunile experimentale. Au fost menținute pe un ciclu de lumină-întuneric de 12: 12-ore, cu luminile aprinse la 0600. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor VAPSHCS.

Operație la șobolani.

Fiecare șobolan a fost echipat cu un cateter duodenal pentru perfuzii de substanțe de testat și, de asemenea, cu un cateter cu venă jugulară pentru prelevarea de probe de sânge în serie, fără perturbări, conform procedurilor descrise anterior mai detaliat (69).

Plasarea și testarea cateterului de hrănire duodenală.

Șobolanii au fost anesteziați cu un amestec de 60 mg/kg ketamină și 3 mg/kg xilazină (Phoenix, St. Joseph, MO), administrat intraperitoneal. Un cateter duodenal a fost introdus la 2 cm distal de pilor printr-o gaură de puncție realizată cu un ac de calibru 18. Tubulatura silastică (diametru exterior 0,047 in., Diametru interior 0,025 in., Braintree Scientific, Braintree, MA) a fost legată de o mică bucată de plasă chirurgicală Bard (Davol, Cranston, RI). După inserare, ansamblul cateter-plasă a fost legat de intestin cu o pungă cu trei bucle de sutură de mătase 6-0 (US Surgical, Norwalk, CT).

Plasarea cateterului venei jugulare.

Vena jugulară dreaptă a fost canulată cu tuburi Silastic (diametru exterior 0,037 in., Diametru interior 0,02 in., VWR), introdus printr-o incizie cutanată de 2 cm. Capătul proximal al tubului a fost tunelat subcutanat la cap, pe care a fost fixat, împreună cu cateterul intestinal, folosind un capac cranian acrilic (Lang Dental, Wheeling, IL) (73).

Protocol experimental.

Șobolanii s-au recuperat după o intervenție chirurgicală timp de cel puțin 2 săptămâni înainte de a fi testați. Au fost obișnuiți să locuiască în cuști de testare a plexiglasului (30 × 25 × 35 cm) timp de două nopți înainte de începerea fiecărui experiment. La 1700 din ziua anterioară perfuziilor, animalele au fost plasate individual în cuștile experimentale, permițând perfuzii intestinale și prelevări repetate de sânge fără a deranja șobolanii. Pentru a stabili niveluri ridicate de grelină inițială, alimentele au fost reținute timp de 18 ore înainte de fiecare sesiune experimentală. Cu o oră înainte de perfuzii, capacul fiecărui animal a fost conectat cu linii separate (PE-100, VWR) pentru prelevarea de sânge și, respectiv, administrarea perfuzatelor. Infuziile au fost inițiate la 1100, iar sângele a fost prelevat în mod repetat în perioada următoare de 5 ore. Infuzatele au fost administrate în ordine aleatorie, distanțate la cel puțin 6 zile una de cealaltă.

Prelevarea și analiza sângelui.

Cu cinci minute înainte de începerea fiecărei perfuzii de nutrienți, a fost extrasă o probă de sânge de bază (volum: 300 μl) din cateterul venei jugulare și s-au recoltat probe suplimentare la 30, 60, 90, 120, 180, 240 și 300 de minute debutul perfuziei. Nivelurile de glucoză din sânge au fost analizate imediat cu un glucometru portabil (Accu-Check, Roche, Indianapolis, IN). Sângele rămas a fost transferat în tuburi de microcentrifugă de 0,5 ml conținând 10 pl EDTA 7,5% și plasat imediat pe gheață. Între 2 și 3 ore după recoltare, probele de sânge au fost centrifugate, iar plasma a fost extrasă și depozitată la -80 ° C. Nivelurile plasmatice ale grelinei totale au fost măsurate prin radioimunotest folosind un anticorp primar împotriva grelinei de șobolan și a grelinei marcate cu 131 I ca trasor (trusa RK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA) (17). Acest test detectează atât grilina acilată, cât și cea des-acilă. Deși grelina acilată este forma bioactivă primară, nivelurile celor două forme se corelează strâns între ele într-o mare varietate de manipulări fiziologice care afectează concentrațiile de grelină (4, 26, 61, 63). Insulina plasmatică a fost măsurată printr-un test radioimuno comercial (kit SRI-13K Linco Research, St. Charles, MO).

Infuzii în studiul 1: suprimarea grelinei prin perfuzii duodenale de agenți cu diferite cinetică de absorbție și metabolism la trei niveluri de osmolaritate.

Infuzii în studiul 2: suprimarea grelinei prin infuzii duodenale de soluție salină izo- și hiperosmolară.

tabelul 1.

suprimarea

Infuziile de lactuloză intestinală au suprimat și grelina. A existat un efect semnificativ al dozei asupra GN, D-AUC3h, dar nu asupra D-AUCtotal, ceea ce subliniază că suprimarea grelinei a avut loc în principal în primele ore după perfuzie (Tabelul 1; Fig. 1C). Efectele asupra D-AUC3h au fost susținute în continuare de o diferență semnificativă statistic între cea mai mare doză de lactuloză și soluție salină. Nu s-au găsit efecte semnificative statistic pentru TGN. Astfel, grelina poate fi suprimată prin soluții hiperosmolare de lactuloză, care rămâne nedigerată și neabsorbită din intestinul subțire și care nu stimulează semnificativ glicemia sau nivelul insulinei.

Mai mult, efectele perfuziilor de glucoză, 3-O-MG și lactuloză au fost comparate la trei niveluri osmotice: izotonice, de 2,5 ori hipertonice și de 5 ori hipertonice. De asemenea, soluția salină hipertonică (din studiul 2) a fost inclusă în această analiză.

La nivel hiperosmolar de 5 ori, soluțiile cu substanțe diferite au exercitat efecte diferite asupra GN, D-AUC3h și D-AUCtotal (Tabelul 1), reflectând o supresie mai eficientă a grelinei prin glucoză hiperosmolară decât prin soluție salină hiperosmolară, lactuloză și 3-O -Soluții MG. Nu s-au observat diferențe în TGN.

În condițiile de perfuzie hiperosmolară de 2,5 ori, s-a găsit un efect principal pentru tipul de perfuzie pentru GN (Tabelul 1), susținut de o supresie a grelinei semnificativ mai mare după glucoză decât după perfuziile cu 3-O-MG. La acest nivel osmotic, nu s-au găsit efecte de tip perfuzie pentru D-AUC3h, D-AUCtotal sau TGN.

Cea mai mică doză izotonică dintre toate cele trei perfuzate a suprimat nivelurile de grelină cele mai puțin eficiente. De asemenea, la acest nivel de osmolaritate, nu s-au găsit diferențe între agenți în ceea ce privește GN, D-AUC3h, D-AUCtotal sau TGN.

Răspunsurile la insulină plasmatică și glucoză din sânge au fost analizate pentru cele mai mari doze (de 5 ori hipertonice) de glucoză, lactuloză și 3-O-MG. Un efect principal al tipului de perfuzie [nivelul de vârf; F (2.13) = 7.9, P = 0.006] a dezvăluit un răspuns de insulină mult mai mare la glucoză decât la infuzii de lactuloză sau 3-O-MG (Fig. 2A). Infuziile de glucoză au crescut semnificativ nivelul de insulină (de 10 ori), în timp ce lactuloza a provocat o creștere minimă și tranzitorie a insulinei, iar perfuziile cu 3-O-MG nu au provocat deloc o creștere. Nivelurile de glucoză din sânge au crescut mai mult după perfuziile de glucoză decât după perfuziile cu lactuloză (creșteri maxime de 3,1 și respectiv 0,2 mmol/l; P Fig. 2B). Creșterea măsurată și durabilă a valorilor glicemiei după perfuzii cu 3-O-MG este probabil un artefact cauzat de o combinație de 1) reactivitate încrucișată a 3-O-MG în circulație cu senzorul de glucoză al dispozitivului de măsurare și 2) absent răspuns la insulină, astfel încât îndepărtarea 3-O-MG din circulație nu este susținută de transportul stimulat de insulină, deoarece este pentru glucoză. Într-adevăr, studiile anterioare care utilizau teste mai specifice pentru 3-O-MG au arătat niveluri nealterate de glucoză din sânge și recuperare aproape completă în urină de 3-O-MG după perfuzii orale (9, 13). Citirile glucometrului din studiul nostru implică, totuși, că absorbția intestinală subțire a 3-O-MG este rapidă și extinsă și că supresia grelinei legată de hiperosmolaritate nu necesită creșteri ale insulinei plasmatice sau ale glucozei din sânge.