Universitatea de Afiliere din Campinas (UNICAMP), Facultatea de Inginerie Alimentară (FEA), Campinas, São Paulo, Brazilia
Universitatea de Afiliere din Campinas (UNICAMP), Facultatea de Inginerie Alimentară (FEA), Campinas, São Paulo, Brazilia
Universitatea de Afiliere din Campinas (UNICAMP), Facultatea de Inginerie Alimentară (FEA), Campinas, São Paulo, Brazilia
Universitatea de Afiliere din Campinas (UNICAMP), Institutul de Biologie (IB), Campinas, São Paulo, Brazilia
Universitatea de Afiliere din Campinas (UNICAMP), Institutul de Biologie (IB), Campinas, São Paulo, Brazilia
Universitatea de Afiliere din Campinas (UNICAMP), Institutul de Biologie (IB), Campinas, São Paulo, Brazilia
Universitatea de Afiliere din Campinas (UNICAMP), Facultatea de Inginerie Alimentară (FEA), Campinas, São Paulo, Brazilia
- Priscila Neder Morato,
- Pablo Christiano Barboza Lollo,
- Carolina Soares Moura,
- Thiago Martins Batista,
- Rafael Ludemann Camargo,
- Everardo Magalhães Carneiro,
- Jaime Amaya-Farfan
Cifre
Abstract
Citare: Morato PN, Lollo PCB, Moura CS, Batista TM, Camargo RL, Carneiro EM și colab. (2013) Hidrolizat de proteine din zer crește translocarea GLUT-4 către membrana plasmatică independentă de insulină la șobolanii Wistar. PLOS ONE 8 (8): e71134. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071134
Editor: Angel Nadal, Universitatea Miguel Hernández de Elche, Spania
Primit: 24 aprilie 2013; Admis: 26 iunie 2013; Publicat: 30 august 2013
Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de FAPESP (Proc. 2012/05859-7), CNPq și CAPES. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.
Interese concurente: Hilmar Ingredients, Brazilia a donat proteinele din zer utilizate în acest studiu. Nu există alte brevete, produse în curs de dezvoltare sau produse comercializate de declarat. Acest lucru nu modifică aderarea autorilor la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.
Introducere
Diferite proteine alimentare pot afecta metabolismul muscular în diferite moduri, după cum se arată atunci când efectele proteinelor din zer (WP) sunt comparate cu cele ale cazeinei (CAS) [1] - [3]. O diferență între WP și CAS este că WP stimulează o creștere a sintezei de acizi grași în mușchi însoțită de o scădere concomitentă a sintezei de acizi grași în ficat, considerată a fi un efect pozitiv asupra metabolismului lipidelor [4]. Hidroliza proteinei singură ar putea modifica funcția biologică a proteinei, afectând astfel metabolismul [5]. De exemplu, s-a sugerat că o ușoară modificare a formei fizico-chimice a proteinelor atunci când este prezentată animalului poate fi suficientă pentru a influența metabolismul general, aparent ca urmare a diferitelor peptide care sunt generate în timpul hidrolizei enzimatice parțiale a proteinelor din zer. (WPH) [3], [6] - [8]. Peptidele bioactive prezente în WPH ar putea fi capabile să reducă nivelurile de creatin kinază la jucătorii de fotbal [9].
Modificările metabolismului glicogenului au fost cel mai probabil cel mai frecvent raportat caracteristică pozitivă rezultată din înlocuirea WP cu WPH [7], [8], [10]. Morifuji și colab. [6] a arătat că din șapte posibile dipeptide care conțin aminoacizi cu lanț ramificat care se găsesc în proteinele din zer din lapte, peptida Ile-Leu a fost capabilă să crească absorbția glucozei de către mușchiul de șobolan izolat. Aceste rapoarte sugerează că WP promovează răspunsuri fiziologice diferite de cele ale CAS, cum ar fi o performanță mai mare a exercițiilor de rezistență [11], niveluri glicemice post-epuizare mai bune și niveluri mai ridicate de glicogen [7], [8], [10]. Glicogenul muscular este principala sursă de combustibil în timpul exercițiilor prelungite de intensitate moderată până la mare [12], astfel încât o creștere a glicogenului ar putea însemna o performanță fizică crescută.
Două izoforme din familia transportoare facilitatoare de glucoză, GLUT-4 și GLUT-1, sunt exprimate în mușchiul scheletic [13]. GLUT-1 este prezent în cantități foarte mici în mușchiul scheletic și sa sugerat că influențează absorbția bazală a glucozei de către mușchi [14]. Abundența proteinei GLUT-4 este un factor primar în determinarea ratei maxime de transport a glucozei în mușchiul scheletic. În condiții normale de odihnă, majoritatea moleculelor GLUT-4 locuiesc în vezicule membranare din interiorul celulei musculare. Ca răspuns la contracțiile insulinei sau musculare, GLUT-4 se translocează în membrana celulară, unde este inserat pentru a crește transportul glucozei [15], [16].
Având în vedere că consumul fie de proteine din zer (WP), fie de hidrolizat de proteine din zer (WPH) are ca rezultat o creștere a depozitelor de glicogen în mușchiul scheletic, prezentul studiu a fost conceput pentru a investiga ipoteza că un astfel de efect ar putea fi datorat translocării crescute a GLUT- 4 la membrana plasmatică. În acest scop, au fost determinați mai mulți parametri de metabolism care includeau următoarele: nivelurile de GLUT-4, GLUT-1, p85, Akt, fosforilat-Akt, glicogen, insulină serică și aminoacizi plasmatici la șobolani Wistar. Acești parametri au fost evaluați pentru cele două tipuri de proteine, folosind cazeina ca control, sub două stări de activitate fizică, sedentară și exercitată.
Materiale și metode
Patruzeci și opt de șobolani Wistar masculi (~ 150 g; n = 8 pe grup) au fost împărțiți în grupuri sedentare și exercitate și fiecare grup a fost hrănit cu cazeină (CAS, martor), proteine din zer (WP) sau hidrolizat de proteine din zer (WPH) ca sursa lor de proteine dietetice pentru un total de 9 zile. Toate animalele au fost postite peste noapte pentru a ajunge la rezerve de glicogen similare, dar cu două ore înainte de sacrificiu, fiecare a primit câte 2 g din dieta experimentală adecvată (Figura 1). Consumul de alimente a fost determinat la fiecare două zile, iar masa corporală a fost monitorizată săptămânal. Când animalele au atins g150 g, au fost repartizate aleatoriu în grupuri, iar câștigul de masă corporală a fost verificat după o săptămână. Metodologia de cercetare a fost aprobată de Comitetul de etică pentru experimentarea animalelor (CEEA-UNICAMP, protocol 2376-1/2011).
Patruzeci și opt de șobolani Wistar au fost împărțiți în 6 grupuri (n = 8 per grup), care corespund celor trei diete: cazeină (CAS), proteine din zer (WP), hidrolizat de proteine din zer (WPH) și două regimuri de exerciții (sedentar și exercițiu) . Animalele hrănite cu diete experimentale timp de 9 zile, iar în ultima zi, toți șobolanii au postit peste noapte pentru a ajunge la rezerve de glicogen similare, dar cu două ore înainte de sacrificiu, fiecare a primit câte 2 g din dieta experimentală adecvată.
Distribuția greutății moleculare a peptidelor WPH a arătat 40,5% Tabelul 1. Compoziția dietelor (g/kg dietă).
Parametrii biochimici
Probele de sânge au fost colectate în Vacutainers, menținute la 4 ° C și apoi centrifugate la 3000 g (4 ° C, 12 min) pentru a obține serul. Evaluarea serurilor a inclus următoarele: acid uric, uree, aspartat aminotransferază (AST), alanină aminotransferază ALT, creatin kinază (CK) și lactat dehidrogenază (LDH). Determinările spectrofotometrice enzimatice standard au fost efectuate folosind truse Laborlab (São Paulo, Brazilia). Pentru analiza glicogenului, au fost colectate probe de mușchi scheletic, inimă și ficat. Glicogenul tisular a fost izolat și purificat prin precipitare cu etanol după digestia bazică, apoi a fost cuantificat prin metoda acidului fenol-sulfuric [19]. Nivelurile serice de insulină au fost măsurate utilizând o insulină ELISA de șobolan/șoarece (Millipore), iar concentrațiile de glucoză au fost măsurate utilizând un glucometru Accu-Chek Active (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania).
Extracția și imunoblotarea proteinelor
Determinarea aminoacizilor liberi în plasmă
Aminoacizii liberi au fost extrasați din plasmă folosind metanol și derivatizați cu fenilizotiocianat [22], iar derivații PTH au fost cromatografiați utilizând un Luna C-18, 100 Å; 5 µ, 250 × 4,6 mm (00 G-4252-EQ) coloană la 50 ° C. Cuantificarea a fost efectuată prin comparație cu un amestec standard, iar standardul intern a fost acidul DL-2-aminobutiric (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, SUA). Aminoacizii liberi s-au extras în etanol 80% și HCI 0,1 M, cu 500 pl de acid 2-aminobutiric adăugat ca standard intern. Amestecul a fost sonicat timp de 10 minute și omogenizat în continuare timp de 1 oră, urmat de centrifugare la 8.500 g timp de 15 minute. Supernatantul a fost filtrat printr-o membrană de 0,22 mm, o alicotă de 40 uL a fost derivatizată așa cum s-a descris mai sus și 20 uL a fost injectat în cromatograful lichid.
Analize statistice
Rezultatele au fost supuse analizei statistice utilizând software-ul SPSS (pachetul statistic pentru științele sociale, Chicago, Statele Unite), versiunea 17.0. Datele au fost testate pentru normalitate (testul Kolmogorov-Smirnov) și omogenitate utilizând instrumentele disponibile în acesta. Pentru datele parametrice, a fost utilizată analiza multivariată a varianței (ANOVA), iar mediile au fost comparate (testul Duncan), adoptând valoarea p Figura 2. Efectul diferitelor proteine dietetice în homeostazia glucozei.
Mijloace și erori standard pentru concentrațiile de: A) GLUT-4; B) GLUT-1; C) p85/tubulină; D) Nud/tubulin; E) Akt fosforilat (Ser 473)/tubulină în mușchiul scheletic; F) insulină serică; și a glicogenului: G) inima; H) mușchiul scheletic și Eu) ficat. Efectul a 9 zile de proteine din zer dietetice (WP [bara cenușie], n = 8) și hidrolizat de proteine din zer (WPH [bara neagră, n = 8) asupra șobolanilor Wistar sedentari și exercitați (în banda de alergare). Grupul de control a primit dieta standard de cazeină (CAS [bare albe], n = 8). Dietele AIN93-G WP și WPH au fost preparate prin înlocuirea cazeinei din dieta standard AIN93 cu proteine din zer sau hidrolizat de proteine din zer. ANOVA a fost utilizat pentru tratamentul statistic al datelor și s-au comparat mediile (testul Duncan), adoptând valoarea p 0,05).
Modificarea proteinelor alimentare nu a avut niciun efect (p Tabelul 4. Media (M) și eroarea standard a mediei (SEM) a concentrațiilor de aminoacizi în plasmă.
Discuţie
Pe baza constatărilor anterioare ale prezentului [3], [7], [8] și altor autori [10], [23], care arată clar că consumul de WP și WPH a crescut nivelul de glicogen muscular și hepatic, obiectivul prezentului studiu a fost de a verifica efectul pe care consumul de WP și WPH l-a avut asupra translocației transportorilor de glucoză GLUT-4 și GLUT-1 la membrana plasmatică (PM), în comparație cu șobolanii hrăniți cu o dietă standard (AIN93-G) cu cazeină ca sursă de proteine. Rezultatele au arătat în mod clar că consumul de WP și WPH a crescut translocația GLUT-4 (Figura 2A) în comparație cu animalele hrănite cu cazeină, în timp ce GLUT-1 (Figura 2B) nu a răspuns la diferitele proteine. Această creștere a GLUT-4 în PM a fost în concordanță cu creșterea glicogenului (Figura 2G - I), deoarece cu mai mulți transportori de glucoză în celula PM, disponibilitatea sintezei de glucoză și glicogen ar putea crește. Se știe că exercițiul fizic crește potențialul de translocare a GLUT-4 către membrană [16], [24] și pentru toate dietele, animalele exercitate au demonstrat niveluri mai ridicate de GLUT-4 în PM.