Affiliation Dipartimento di Ricerca Traslazionale e Delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia, Università di Pisa, Pisa, Italy

exprimate

Affiliation Dipartimento di Biologia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Scienze Agrarie, Genetica Alimentari e Agro-Ambientali, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Ricerca Traslazionale e Delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Biologia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Scienze Agrarie, Genetica Alimentari e Agro-Ambientali, Università di Pisa, Pisa, Italy

Affiliation Dipartimento di Scienze Economico-Estimative e degli Alimenti, Sezione di Chimica Bromatologica, Biochimica, Physiologia e Nutrizione, Università degli Studi di Perugia, Perugia, Italy

  • Giuseppe Federighi,
  • Monica Macchi,
  • Rodolfo Bernardi,
  • Rossana Scuri,
  • Marcello Brunelli,
  • Mauro Durante,
  • Giovanna Traina

Cifre

Abstract

Citare: Federighi G, Macchi M, Bernardi R, Scuri R, Brunelli M, Durante M, și colab. (2013) Gene exprimate diferențial în Hirudo medicinalis Ganglia după tratamentul cu acetil-L-carnitină. PLOS ONE 8 (1): e53605. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053605

Editor: Tiansen Li, National Eye Institute, Statele Unite ale Americii

Primit: 20 august 2012; Admis: 30 noiembrie 2012; Publicat: 4 ianuarie 2013

Finanțarea: Lucrarea a fost susținută de Laboratoarele Sigma-Tau (Pomezia, Italia). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Acest lucru nu modifică aderarea autorilor la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Materiale și metode

Animale

Au fost utilizate lipitori adulți H. medicinalis (în vârstă de 8-10 luni) cumpărate de la Ricarimpex (Eysines, Franța). Animalele au fost ținute într-un acvariu la 15-16 ° C, expuse ciclului de lumină/întuneric natural. ALC sau soluție salină a fost furnizată dorsal prin două injecții (una în rostral și cealaltă în arta caudală a corpului lipitorului), fiecare din 100 pl/g animal, așa cum sa raportat în Ristori și colab. [6]. ALC a fost proaspăt preparat, dizolvat în soluție salină și, dacă este necesar, tamponat la 7,4 pH cu NaOH înainte de utilizare. Soluție salină conținută: NaCl 115 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1,8 mM, glucoză 10 mM, tamponată la 7,4 pH cu 10-mM Tris-maleat.

Izolarea totală a ARN-ului

Un grup de lipitori a fost injectat cu soluții fiziologice (grupul martor, C), în timp ce un alt grup cu ALC 2 mM (Laboratoarele Sigma Tau, Pomezia Italia) (grupul tratat, T). La unsprezece zile după tratament, ARN-ul total a fost izolat conform lui Macchi și colab. [23] și stocate la -80 ° C până la izolarea ARN.

Construcția bibliotecii SSH

ARN-urile Poly (A) + au fost izolate din grupurile de ARN-uri totale de control și lipite tratate folosind sistemele de izolare PolyATract® mRNA (Promega, Madison, Wi, SUA) în conformitate cu protocolul descris de producător. Hibridizarea supresivă subtractivă (SSH) a fost efectuată în conformitate cu Diatchenko și colab. [24] folosind kitul de scădere a cDNA BD PCR-Select (BD Biosciences) după utilizarea kitului de sinteză BD SMART ™ PCR cDNA (BD Biosciences Clontech). Procedura SMART necesită 0,025-1 µg de poli (A) + mARN pentru a permite amplificarea populației complete de mARN conținută în fiecare probă (tratată și martor). ADNc-urile din probele tratate au fost utilizate, respectiv, ca tester și driver pentru scăderea directă și inversă, în conformitate cu kitul de scădere a ADN-ului BD PCR-Select.

Secvențele de ADNc amplificate din scăderile înainte și înapoi au fost inserate direct într-un vector de clonare T/A folosind kitul de clonare TOPO TA (Invitrogen, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

Eficiența scăderii a fost evaluată prin amplificarea PCR utilizând gena ribozomală 5.8S (scăderea a fost eficientă dacă transcrierea 5.8S a fost redusă); primerii au fost proiectați pe gena ARNr 5.8S a Xenopus laevis (numărul de acces X02995.1) (Tabelul 1).

Screening diferențial al bibliotecilor ADNc scăzute

Clonele obținute au fost cultivate în mediu LB cu 10 mg/ml ampicilină în plăci cu 96 de godeuri la 37 ° C. Fragmentele de ADNc au fost amplificate prin PCR cu primeri PCR cuibărite 1 și 2R, care erau complementari cu adaptorii, pentru a verifica prezența și dimensiunea fragmentelor individuale.

Secvențierea și analiza clonelor

Clonele exprimate diferențial au fost secvențiate prin secvențierea automată (MWG Biotech Ebersberg, Germania). Căutările omologice ale tuturor secvențelor au fost comparate cu baza de date GenBank EMBL-EBI utilizând algoritmul BLAST.

RT-PCR relativ cantitativ

Transcrierile inversate au fost efectuate cu ARN total (4 µg), tratate anterior cu DNază I (Roche), izolate din lipitori tratate ALC și control cu ​​SuperScript ™ II RNază H- Reverse Transcriptază kit (Invitrogen) și Oligo (dT) 12-18 Grund (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului.

Pentru fiecare amplificare PCR s-au utilizat 1 ofl de ADNc din prima catenă, iar PCR-urile au fost efectuate folosind primeri specifici genei și gena ARNr 5.8S a Xenopus laevis (nr. . 1) au fost folosite ca gene de menaj. Exemple de secvențe sunt raportate în Tabelul 1.

Cantitățile relative ale fiecărui produs PCR au fost cuantificate cu ușurință prin scanare directă cu un densitometru de electroforeză cu gel de agaroză 2% colorat cu bromură de etidiu cu software Quantity One® (Bio-Rad, SUA). Pentru a standardiza ARN-ul total și eficiența sintezei ADNc a probelor, intensitățile benzii au fost standardizate cu intensitatea medie a produsului 5.8S sau Tubulin pe toate probele investigate. Raportul dintre valoarea nivelului produsului genetic analizat și nivelul produsului 5.8S sau Tubulin al fiecărei probe a fost calculat din trei experimente independente efectuate pentru fiecare genă. Analiza statistică a fost realizată cu testul Unpaired T (software GraphPad Prism 4.00). Toate datele sunt exprimate ca valori medii ± SE.

Rezultate

Scopul acestei cercetări a fost de a identifica gene care sunt exprimate diferențial în sistemul nervos lipitor ca răspuns la un singur tratament ALC. Pentru a detecta genele exprimate diferențial, au fost utilizate două grupuri de lipitori: primul grup a fost supus unei singure administrări de 2 mM ALC și al doilea a fost supus unei singure administrări de soluție salină. La unsprezece zile după tratament, au fost extrase lanțuri de ganglioni de la ambele grupuri de animale, iar ARN-ul total a fost izolat. Am realizat metoda hibridizării subtractive de suprimare (SSH) [24] pentru construirea a două biblioteci de ADNc subtractive: bibliotecile înainte și inversă constând din transcrieri modulate pozitiv și respectiv negativ, prin tratamentul cu ALC. Eficiența scăderii a fost evaluată prin amplificarea PCR a genei menajere pentru ARNr 5.8S. Fragmentele sunt detectabile ca benzi slabe în eșantionul scăzut numai după amplificarea PCR, în timp ce sunt în mod clar detectabile în eșantionul nedusat.

Au fost colectate aproximativ 400 de clone ADNc pentru fiecare bibliotecă ADNc și clonele care prezintă o singură bandă după amplificarea PCR au fost secvențiate. Aproximativ 70% din clonele de ADNc analizate din toate bibliotecile au rezultat exprimate diferențial. Am secvențiat 40 de clone de ADNc exprimate diferențial, aparținând diferitelor biblioteci de ADNc. Cu informațiile colectate din diferite baze de date, am identificat și atribuit o funcție presupusă mai mult de jumătate din clonele secvențiate (tabelele 2-3). Secvențele considerate interesante din punct de vedere fiziologic sunt prezentate în Tabelul 2: raportăm și câteva secvențe extraterestre din Tabelul 3 care pun câteva întrebări interesante care vor fi analizate în discuție.

Așa cum se arată în tabelele 2-3 1AE6, 1AF6 și 1AE5 clonează codul pentru Actinin, HPS90 și respectiv enzima biosintetică tiazolică. În mod surprinzător, ultima clonă codifică o proteină, enzima biosintetică tiazolică, care este exprimată în general numai în plante. Proteinele Actinin și HPS90 sunt implicate la diferite niveluri în activitatea neuronală. Deoarece am observat anterior că un singur tratament cu ALC în lipitoare afectează formele de învățare neasociativă (6), aici ne-am gândit că ar fi interesant să subliniem dacă tratamentul cu ALC modulează expresia genelor care codifică aceste proteine. Tehnica RT-PCR relativă a fost utilizată pentru a analiza expresia clonelor 1AE6, 1AF6 și 1AE5. Rezultatele obținute au arătat că ALC modulează pozitiv expresia genelor care codifică: Actinin (ALC 0,757 ± 0,034, Control 0,326 ± 0,029; n = 3; t = 9,645, df = 4, p = 0,0006; Fig.1A), HSP90 ALC 0,766 ± 0,043, Control 0,383 ± 0,021; n = 3; t = 8,004, df = 4, p = 0,0013; Fig. 1B) și enzima biosintetică tiazolică (ALC 1,310 ± 0,040, Control 0,991 ± 0,081; n = 3; t = 3.531, df = 4, p = 0.0242; Fig. 1C).

RT-PCR relativ (stânga) al transcrierilor enzimei biosintetice (C) ale actininei (A), HSP90 (B) și ale tiazolului. Nivelurile relative de expresie (dreapta) au fost calculate ca un raport al fiecărei transcrieri analizate în raport cu nivelurile de produs Tubulin sau 5.8S. Valorile urmate de litere diferite sunt semnificativ diferite la nivelul de probabilitate 0,05 conform testului T nepereche. ALC și C, tratate și, respectiv, lipitori. M, marker de greutate moleculară.

Discuţie

Enzima biosintetică pentru tiazol este o enzimă implicată în biosinteza tiaminei (vitamina B1) [46], necesară în metabolismul proteinelor, glucidelor și grăsimilor. Printre funcțiile sale diferite, coenzima tiamină este importantă și în sinteza acetilcolinei, glutamatului și GABA [47], iar deficiența sa poate juca un rol important în unele tulburări neurodegenerative [48], [49], [50], cum ar fi boala Alzheimer și encefalopatia Wernicke [51]. În cele din urmă, tiamina și alte vitamine din grupul B par să aibă efecte antinociceptive și antiinflamatorii importante [52] - [55]. prin urmare, acestea sunt utile pentru tratamentul anumitor afecțiuni ale durerii, cum ar fi durerile lombare sau nevralgia trigemenului [52], [53]. ALC crește expresia genei care codifică enzima biosintetică pentru tiazol și acest efect ar putea fi legat de acțiunea anti-nociceptivă a medicamentului.

Problema tulburătoare care apare este că biosinteza tiaminei este în mod normal codificată în genomul plantelor, dar nu și în genomul animalului.

În ceea ce privește găsirea genelor de plante extraterestre, trebuie subliniat faptul că mai multe gene de plante se găsesc în diferite sisteme animale. În analiza comparativă a genomului EST-urilor planare, Mineta și colab. [56] au constatat că aproximativ 30% din genele legate de sistemul nervos planar aveau secvențe omoloage în Arabidopsis și drojdie. Autorii speculează că în timpul evoluției multe gene, care sunt funcționale în sistemul nervos sau SNC, ar fi putut fi recrutate din gene utilizate în sistemele unicelulare. Este demn de remarcat faptul că în sistemul nostru secvențele extraterestre sunt prezente ca clone, dar genele corespunzătoare nu au fost găsite în ADN-ul lipitorului (rezultate nepublicate).

Korneev și colab. [57] au construit o bibliotecă de ADNc subtractivă din celulele Retzius regeneratoare ale lipitorului: printre secvențele reglate în sus în timpul regenerării nervilor a fost găsită o ipotetică proteină de drojdie 39,4.

Blackshaw și colab. [44] în studiile lor privind baza moleculară a reparării sistemului nervos în celulele nervoase H. medicinalis, au găsit două clone care codifică o proteină de șoc termic HSP90 și un ARN ribozomal 16S ca cele raportate în Tabelul 2 al acestei lucrări. Mai mult decât atât, au găsit o clonă care codifică o enzimă Arabidopsis thaliana ubiquitin-conjugating (UCE) și o altă codificare pentru subunitatea II a citocrom oxidazei din alga roșie Cyanidium caldarium: interesant, acestea au fost reglate în sus la 24 ore post-axotomie.

Se poate face ipoteza unei relații simbiotice cu algele unicelulare. Acest tip de interacțiuni este bine cunoscut în diferite sisteme (pentru o revizuire a se vedea Venn și colab. [58]). Mai recent, s-a găsit o asociere între embrionii salamandrei Ambystoma maculatum și alga verde Oophila amblystomatis [59]. Autorii au considerat această asociație ca o instanță a mutualismului ectosymbiontic.

Aljamali și colab. [60] în analiza transcriptomică a glandelor salivare Amblyomma americanum, s-a găsit o secvență de nodul rădăcină Pisum sativum estensină. Mai mult, un contingent al bibliotecii a fost foarte asemănător cu precursorul nespecific al proteinei 1 de transfer lipidic Lens culinaris (LTP1). Autorii au emis ipoteza posibilei implicări într-o absorbție nespecifică a acidului arahidonic. Este demn de remarcat faptul că în biblioteca noastră este prezentă o secvență LTP2.

O lucrare recentă interesantă și pusă la îndoială de Zhang și colab. [61] au raportat dovezi ale reglării încrucișate de către microARN-ul plantelor exogene în seruri și țesuturi ale diferitelor animale. Potrivit autorilor, miARN-urile vegetale sunt în principal dobândite pe cale orală, prin aportul de alimente.

În concluzie, datele colectate în această lucrare relevă un efect de durată al ALC care modulează expresia genelor. Deși rezultatele noastre nu explică pe deplin efectele observate anterior în comportament, arătăm că o singură administrare de ALC este capabilă să afecteze expresia genelor în sistemul nervos al lipitorului H. medicinalis. Anterior, am detectat o modulație a expresiei genice de către ALC în creierul șobolanului [17] - [22]. Prin compararea bibliotecilor de genom obținute în ambele modele animale nu am găsit gene comune a căror expresie a fost modulată de ALC, cu excepția unor HSP. Această diferență în expresia genei modulate de ALC ar putea depinde de diferite modalități de tratament (administrare unică în lipitor și tratament cronic la șobolan). De asemenea, timpul la care au fost efectuate analizele (11 zile după tratamentul unic în lipitor și imediat după tratamentul la șobolan) ar putea explica diferența observată în expresia genică, precum și distanța filogenetică între modelele animale.

Cu toate acestea, utilizarea SSH a permis construirea bibliotecii ADNc în H. ​​medicinalis și identificarea genelor diferențiale exprimate ca răspuns la un tratament farmacologic specific, reprezentând astfel un instrument bun pentru viitoarele investigații în biologia moleculară a sistemului nervos lipitor.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: RB MB GT. A efectuat experimentele: MM. Analiza datelor: GF RB MD GT. Am scris lucrarea: MD GT. Contribuție la editarea și revizuirea manuscrisului: GF RB RS MB MD GT. Supervizor al proiectului: MB MD GT.