Radhakrishnan Padmanabhan

1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Școala de Medicină a Universității Georgetown, Washington DC 20057

vitro

Ratree Takhampunya

1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Facultatea de Medicină a Universității Georgetown, Washington DC 20057

Tadahisa Teramoto

1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Școala de Medicină a Universității Georgetown, Washington DC 20057

Kyung H. Choi

2 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Filiala Medicală a Universității din Texas, Galveston, TX 77555-0156

rezumat

Stabilirea sistemelor in vitro pentru studierea mecanismelor de sinteză a ARN-ului pentru virușii de ARN cu catenă pozitivă au fost foarte utile în trecut și au arătat lumina asupra compoziției proteinelor și a componentelor ARN, condiții optime, natura produselor formate, ARN cu acțiune cis elemente și factori proteici cu acțiune transă necesari pentru o sinteză eficientă. În această revizuire, rezumăm înțelegerea noastră actuală cu privire la cerințele pentru sinteza ARN-ului flavivirus in vitro. Descriem detalii despre condițiile de reacție, specificitatea șablonului utilizat fie de complexul de replicază virală legat de membrană cu mai multe componente, fie de ARN polimerază ARN dependentă recombinată purificată. De asemenea, discutăm perspective viitoare pentru a extinde limitele cunoștințelor noastre.

1. Introducere

1.1. ARN DENV

2. Sinteza ARN DENV in vitro folosind șabloane endogene de ARN viral în complexe de replicare legate de membrană

2.1. Introducere

Flavivirusurile au o gamă largă de gazde și se pot reproduce într-o varietate de celule de mamifere și țânțari. S-a raportat că, deși alphavirusul, virusul Sindbis, poate reproduce și produce antigeni specifici virusului în celulele embioase de pui enucleate, virusul encefalitei japoneze (JEV) nu a putut să producă acest lucru și implicarea nucleară timp de cel puțin 2-4 ore după infecție pentru a fost necesară sinteza antigenului specific virusului [38]. Rolul nucleului pentru această cerință nu este înțeles.

Membranele reticulului endoplasmatic (ER) sunt implicate intim în traducere și replicarea virală în citoplasmă. De fapt, studiile folosind microscopia electronică și metodele de tomografie electronică tridimensională au arătat că replicarea virală are loc în complexele de replicare legate de membrană în compartimentele de membrană ER induse de virus și extinse [39, 40]. Complexele de replicare legate de membrană de la celule infectate cu flavivirus au fost analizate pentru compoziția speciilor de ARN viral de mai multe grupuri. ARN de dimensiune genomică de 40-44S are capac de tip 1 la capătul 5 ′, dar nu are poli (A) la capătul 3 ′ [1, 41-44]. În plus, s-au observat, de asemenea, ARN dublu catenar de 20-22S și ARN heterogen 20-28S probabil replicativă (RF) și intermediară replicativă (RI) [45-48], precum și ARN-uri mai mici de 8-12S ARN în flavivirus -celule infectate [1]. S-a ajuns la concluzia că aceste specii mici de ARN erau produsele de degradare ale ARN-urilor virale [49] întrucât s-a raportat că nu există dovezi pentru activitatea șablonului unui ARN mic într-un studiu anterior [1]. În lumina cunoștințelor actuale, speciile mici de ARN ar putea include probabil ARN-ul subgenomic despre care s-a raportat că este o degradare incompletă a ARN-ului genomic viral de către ARN-urile celulare [50]. Acest ARN mic s-a dovedit a fi esențial pentru citopaticitatea și patogenitatea WNV [50, 51].

2.2. Primele sisteme de studiu a replicării virale in vitro

Noțiunea că membranele celulare au jucat un rol important în ciclul de viață al virusului ARN (+) catena, inclusiv în replicare, a fost cunoscută cel puțin de la sfârșitul anilor 1960 până la începutul anilor 1970 [52, 53]. De exemplu, sinteza ARN picornavirală este inițiată în fracțiune membranară netedă cu o valoare de sedimentare de 130 S în centrifugarea cu gradient de densitate izopicnică a zaharozei, care apoi se maturizează într-un complex de replicare tardivă a structurilor de 250 S. Complexul de replicare a constat din ARN polimerază virală, ARNs, forma replicativă (RF) 20 S și 26 S și forma intermediară replicativă (RI) a ARN viral, respectiv [53, 54]. În studiile anterioare, complexul de replicare endogen legat de membrană a fost caracterizat prin sinteza ARN virală de către Qureshi și Trent folosind celule BHK-21 infectate cu virusul encefalitei Saint Louis (SLE) [55] și de Zebovitz și colab. folosind celulele renale porcine infectate cu JEV, PS (Y-15) [47, 48]. Pentru a caracteriza speciile de ARN din structurile de membrană citoplasmatică care sedimentează la 250 S, celulele BHK-21 infectate cu LES în prezența actinomicinei au fost marcate cu puls cu uridină marcată cu [3H] timp de 30 de minute la 16 ore după infecție [ 55]. Structurile de membrană 250 S, care conțineau

15% din ARN-ul total au fost asociate stabil cu membranele în timpul izolării prin gradienți de densitate a zaharozei care conțin EDTA (20 mM). Au fost identificate trei specii de ARN; cea mai mare a fost RNază sensibilă, 43 S, descendență ssRNA, apoi parțial RNază sensibilă, 26 S, și RNază rezistentă, 20 S ARN specie [55]. Activitatea polimerazei a fracțiunilor gradiente a fost măsurată folosind [3H] GTP în produse marcate cu precipitații acide. Tratamentul extractelor cu deoxicolat de sodiu (DOC) și Brij-58 a dezactivat activitatea enzimei. Activitatea polimerazei a fost dependentă de Mg +2 și 4 NTP, dar inhibată de Mn +2 și RNase. Activitatea enzimatică a fost liniară timp de o oră și a scăzut ulterior [55].

În studiul descris de Zebovitz și colab. [47], membranele citoplasmatice au fost preparate prin liza suspensiei hipotonice a celulelor PS (Y-15) infectate cu JEV și centrifugate la 1000 x g. Fracția nucleară rămasă a fost spălată extensiv pentru a elimina contaminarea citoplasmatică [56]. Fracția nucleară a fost supusă omogenizării Dounce pentru resuspendare în zaharoză 2,3 M conținând 1,5 x 10-3 M CaCl2 și 10 mM tampon Tris-HCI, pH 7,5. Suspensia a fost centrifugată la 35.000 x g timp de 30 de minute. Peleta de nuclee a fost spălată cu 3 până la 4 volume de zaharoză 0,23 M conținând 3 x 10-3 M CaCl2 și centrifugată la 600 x g timp de 5 minute. Nucleii au fost umflați timp de 30 min în 10 volume de tampon fosfat 2 x 10 -2 M, pH 7,2 și supuși omogenizării Dounce [56]. Suspensia nucleară a fost centrifugată la 600 x g pentru a îndepărta nucleele intacte și resturile nucleare. Suspensia fracției de anvelopă nucleară a fost centrifugată la 47.000 x g timp de 20 de minute.

Fracțiile de membrană cu înveliș citoplasmatic și nuclear preparate din celule PS (Y-15) neinfectate și infectate cu JEV la 40 de ore după infecție au fost analizate într-un test RdRp după cum urmează. Amestecul de reacție a fost format din 10 mM Tris-HCI (pH 8,2), 50 μM fosfoenolpiruvat de sodiu, 4 μM acetat de magneziu, 5 μM fiecare din ATP, CTP și UTP nemarcate, 1 μCi de [3 H] GTP și 0,5 ml de celulă -suspensie membranara din celule infectate si neinfectate. Amestecurile de reacție au fost incubate timp de 30 de minute la 37 ° C. Produsele ARN au fost analizate prin gradienți de densitate a zaharozei. Principala specie de ARN formată în reacția in vitro a fost o specie de ARN 20S rezistentă la RNază produsă de fracțiuni de membrană din celule infectate cu JEV. Fracția de membrană a învelișului nuclear din celulele infectate conținea niveluri mai mari de 1,7 până la 4,3 ori mai mari de activități ARN polimerază virală decât fracția de membrană citoplasmatică [48]. Metoda de centrifugare cu gradient de densitate a zaharozei aleasă pentru fracționarea produselor speciilor de ARN sintetizate in vitro de polimeraza virală nu a avut rezoluție și a fost greoaie pentru efectuarea analizelor detaliate.

2.3. Sistemele Westaway și Brinton

Grupurile Westaway și Brinton au dezvoltat sisteme de replicare a ARN-ului in vitro pentru a studia sinteza ARN-ului flavivirusului [[57-61]; pentru o revizuire a se vedea [62] și referințele din acesta). Protocoalele utilizate de aceste două grupuri cu detalii despre modificările și îmbunătățirile sistemelor lor sunt prezentate mai jos.

2.3.1. Protocol pentru izolarea complexului de replicare a virusului Kunjin (KUN) legat de membrană (sistemul Westaway)

2.3.1.1. Pregătirea extractelor citoplasmatice și nucleare din celulele Vero infectate cu KUN

Celulele Vero au fost infectate cu virusul KUN (tulpina MRM61C) pentru izolarea complexului de replicare citoplasmatic legat de membrană [57]. Extractele au fost preparate în diferite momente post-infecție, așa cum este descris [63]. Pe scurt, celulele peletate au fost resuspendate în 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM acetat de sodiu (2,5 x 107 celule/ml). Celulele au fost întrerupte prin trecerea de 20 x printr-un ac de seringă de calibru 20, urmat de 20 x prin ac de seringă de calibru 26. Suspensia celulară a fost centrifugată la 800 x g timp de 7 minute. Peleta nucleară a fost spălată cu același tampon Tris-HCI/acetat de sodiu la 1 x 108 celule/ml și centrifugată la 800 x g. Fracțiile supernatante combinate din două centrifugări au fost alicotate și stocate la -70 ° C ca fracție citoplasmatică. Fracția de pelete nucleare a fost resuspendată în același tampon menționat mai sus la 2 x 107 celule/ml, centrifugată la 500 x g pentru a clarifica supernatantul și depozitată în alicote ca material nuclear la -70 ° C. Fracțiile au păstrat activitățile enzimatice mai mult de 12 luni [58].

2.3.1.2. Testarea RdRp și analiza produselor de ARN formate in vitro

10% din total; [64]). Acest model nu ia în considerare mecanismele implicate în sinteza inițială a ARN-ului catenar (-) de către complexul replicazei virale, dar oferă o bază moleculară pentru rolul de reciclare pentru RF și rezistență relativ ridicată la RNază și degradare lentă a RI [57].

2.3.2. Protocol pentru izolarea complexului de replicare WNV legat de membrană în sistemul Brinton

2.3.2.1. Prepararea fracțiunilor de membrană externă citoplasmatică și nucleară (S1 și S1) din celule BHK-21 infectate cu WNV
2.3.2.2. Test RdRp

tabelul 1

Condiții de reacție pentru activitatea in vitro WNV RdRp §