rezumat

INTRODUCERE

MATERIALE ȘI METODE

Creșterea șoarecilor, pregătirea embrionilor și genotiparea

Cultura feliei de embrioni

Embrionii E7.25 și E7.5 au fost tăiați în jumătăți de-a lungul axei sagittale folosind un bisturiu. O jumătate din fiecare embrion a fost plasată pe un insert de cultură de organe CM millicel (Millipore) pre-acoperit cu colagen IV (BD) și cealaltă jumătate a fost utilizată pentru genotipare. Pentru embrioni E9.0, jumătățile caudale au fost cultivate pe inserții așa cum s-a descris anterior (Molyneaux și colab., 2001). Inserțiile de organe millicell au fost apoi plasate într-o etapă metalică care conținea camere cu fund de sticlă și incubate în 600 μl tampon Hepes mediu DMEM/F-12 (Gibco) cu 0,04% BSA fără lipide și 100 U/ml penicilină/streptomicină (Gibco). Pentru a genera o pierdere acută de semnalizare a oțelului, 10 μg/ml anticorp de blocare c-Kit, Ack2 (un cadou bun de la Dr. Fred Finkelman, CCHMC), a fost adăugat la mediul de cultură felie. Șoarece IgG (10 μg/ml, Jackson ImmunoResearch) a fost utilizat ca control. Feliile de embrioni au fost menținute la 37 ° C prin plasarea etapei metalice într-o etapă cu temperatură controlată (Zeiss) și menținerea umidității cu prosoape de hârtie umede plasate într-un vas de cultură de 100 mm fixat peste camerele de cultură a organelor.

oțel

Analiza time-lapse a PGC-urilor migratoare

Feliile au fost filmate cu un sistem confocal Zeiss LSM510 atașat la un microscop axiovert Zeiss. Imaginile au fost achiziționate la fiecare 5 minute timp de 6 până la 10 ore, iar filmele au fost analizate folosind imaginea NIH așa cum este descris (Molyneaux și colab., 2001). Pe scurt, toate celulele care au rămas focalizate pe durata filmării au fost urmărite, iar viteza medie, viteza maximă și deplasarea au fost măsurate pentru fiecare dintre aceste celule utilizând două macro-uri de urmărire a celulelor scrise pentru software-ul NIH ImageJ de Kathy Molyneaux sau de Erik Meijering. Direcționalitatea lor a fost, de asemenea, înregistrată, iar traiectoria netă pentru toate celulele din fiecare embrion a fost trasată pe o diagramă de vânt. Experimentele s-au repetat de cel puțin trei ori și s-au analizat trei până la opt embrioni pe grup. Pentru comparații statistice, datele au fost analizate folosind un test t al Studentului cu două cozi, fără perechi, cu varianțe egale.

RT-PCR

Pentru analiza RT-PCR, alantoidele de la embrioni E7.5 și crestele genitale de la embrioni E10.5 au fost disecate, iar ARN-ul extras din țesuturile disecate folosind RNeasy Kit (Qiagen). ARN (10 ng) a fost transcris invers utilizând sistemele de sinteză First-Strand Superscript III (Invitrogen), urmând recomandările producătorului. Reacțiile PCR au fost efectuate folosind Redmix Plus (GeneChoice). Exemplele utilizate au fost după cum urmează: factor de oțel legat de membrană, F-5'-TCCCGAGAAAGGGAAAGC-3 ', R-5'-CTGCCCTTGTAAGACTTGACTG-3' (lungimea fragmentului prevăzut, 149 bp); factor de oțel solubil, F-5'-TTATGTTACCCCCTGTTGCAG-3 ', R-5'-CTGCCCTTGTAAGACTTGACTG-3' (lungimea fragmentului prevăzut, 195 bp).

Analiza imunofluorescenței pe embrioni montați întregi sau secțiuni înghețate

Embrionii au fost fixați în 4% paraformaldehidă (PFA). Pentru colorarea în întregime, embrionii au fost apoi spălați în 0,5% NP-40 (2 × 10 minute), blocați în PBSST (PBS/0,3% Triton X-100 cu 5% ser de capră sau măgar, 2 × 1 oră de spălare) și incubat peste noapte la 4 ° C în PBSST cu anticorp primar. A doua zi, embrionii au fost spălați în PBST (PBS/0,3% Triton X-100, 2 × 15 minute, apoi 3 × 1 oră) la 4 ° C, incubate peste noapte la 4 ° C în PBSST cu Cy3- sau Cy5- anticorpi secundari conjugați (Jackson ImmunoResearch), spălat în PBST (2 × 15 minute, apoi 3 × 1 oră) și eliminat în 50%, apoi 90%, glicerol pentru imagistică. Embrionii care trebuie secționați au fost deshidratați în zaharoză și montați în compus OCT (Tissue-Tek) pentru criosecționare. Embrionii secționați au fost rehidratați cu PBST (10 minute), blocați cu PBSST (1 oră la temperatura camerei) și incubați cu anticorp primar peste noapte la 4 ° C. A doua zi, lamele au fost spălate cu PBST (3 × 15 minute), incubate în PBSST cu anticorp secundar (2 ore), spălate cu PBST (2 × 15 minute) și montate cu DABCO (Sigma) pentru imagistică.

REZULTATE

Factorul de oțel este exprimat de celulele care înconjoară PGC-uri pe tot parcursul migrării

Așa cum se arată în FIG. 1B, C, factorul de oțel localizat cu membrană celulară a fost văzut în alantoidă la E7.5. Pentru a confirma prezența factorului de oțel legat de membrană în alantoidă, am fixat embrioni E7.5 cu acid tricloracetic 2% (TCA), ceea ce a dat o reacție încrucișată mai bună cu anticorpul anti-factor de oțel. Fixarea TCA determină pierderea semnalului GFP, astfel încât PGC-urile nu au putut fi identificate. Cu toate acestea, un grup de celule din miezul alantoidei a arătat o colorare puternică a membranei a factorului Steel (Fig. 1J, săgeată). De asemenea, am disecat alantoidele din embrioni E7.5 și am efectuat RT-PCR folosind primerii care disting factorii de oțel legați de membrană și solubili. Rezultatele RT-PCR au confirmat prezența factorului de oțel atât solubil, cât și legat de membrană în alantoidă la E7.5 (Fig. 1K).

PGC exprimă mai întâi Stella în alantoida extraembrionară și migrează proximal în epiblastul posterior

Cadre time-lapse de embrioni E7.25 și E7.5 Stella-GFP. (A) Trei cadre la t = 0, t = 78 minute și t = 156 minute ale unui film au început la E7.25. La t = 0, PGC-urile, detectate prin expresia Stella (verde), sunt vizibile în alantoidă (AL). Expresia reziduală a Stella este, de asemenea, văzută în altă parte a embrionului. PGC-urile încep să se răspândească în jos către epiblast. Săgeata indică granița aproximativă între alantoidă și epiblastul proximal. (B) Trei cadre la t = 0, t = 280 minute și t = 560 minute ale unui film au început la E7.5. PGC se deplasează de la alantoidă în epiblastul posterior al embrionului în timpul perioadei de film. Săgeata indică granița aproximativă între alantoidă și epiblastul proximal. Populația PGC se extinde în epiblast proximal. Barele de scară: 100 μm.

Lucrările recente din laboratorul nostru au arătat că pierderea factorului Steel duce la apoptoza PGC începând cu sau înainte de E9.0, care poate fi salvată prin îndepărtarea proteinei pro-apoptotice Bax (Runyan și colab., 2006). Prin urmare, am examinat embrioni din cruci de oțel/Bax la E7.5. În cinci embrioni Bax +/-, din oțel -/- examinați, pierderea unei alele de Bax a salvat scăderea numărului de PGC în embrioni din oțel -/- la E7.5 (Fig. 3A). La embrionii din oțel -/-, numărul PGC a crescut de la 15 ± 4,3 la 29 ± 9,3 (P = 0,041) în absența unei alele a lui Bax. Exemple de embrioni din care s-au făcut aceste numărări sunt prezentate în Fig. 3B. Aceste date arată că factorul Oțel este un factor esențial de supraviețuire pentru PGC chiar înainte de a intra în intestin și că PGC mor prin calea apoptotică dependentă de Bax la E7.5 atunci când nu au factor Oțel. Datele exclud, de asemenea, posibilitatea ca factorul de oțel să fie necesar pentru specificațiile PGC inițiale, deoarece numărul de PGC a crescut la embrionii Oțel-nul atunci când apoptoza a fost inhibată.

Factorul de oțel este necesar pentru migrarea normală a PGC înainte de intrarea în intestin

Filmele cu intervale de timp au fost realizate folosind embrioni nulați din oțel E7.5 bisectați sagital și colegii lor de gunoi. Exemple de cadre de filme de la embrioni de genotipuri diferite sunt prezentate la timp = 0 și timp = 413 minute (Fig. 4A, B; din Filme 3-5, vezi materialul suplimentar). Am urmărit manual PGC-urile în filme time-lapse, am obținut traiectorii ale tuturor PGC-urilor ale căror rute migratorii au rămas în planul confocal pe tot parcursul filmului (Fig. 4C, D) și am calculat viteza și deplasările mișcării PGC (Fig. 4E) . PGC-urile din embrionii Steel +/+ au fost foarte motrice, cu o viteză maximă de 51,4 ± 3,1 μm/oră, o viteză medie de 24,7 ± 1,2 μm/oră și o deplasare totală medie în timpul filmării de 83,1 ± 8,9 μm. Viteza maximă (50,1 ± 3,3 μm/oră), viteza medie (23,6 ± 1,3 μm/oră) și deplasarea (78,9 ± 10,8 μm) a PGC-urilor din embrionii Steel +/- nu au fost modificate semnificativ față de cele din embrionii Steel +/+ (P = 0,58, 0,23 și respectiv 0,57). Cu toate acestea, PGC-urile din embrionii din oțel -/- au scăzut semnificativ viteza maximă (37,4 ± 2,9 μm/oră), viteza medie (17,5 ± 0,8 μm/oră) și deplasările (44,9 ± 7,7 μm) comparativ cu PGC-urile din oțelul +/+ (P = 1,0 × 10 -6, 3,8 × 10 -10 și respectiv 1,2 × 10 -7) și colegii de gunoi din oțel +/- (P = 1,8 × 10 -7, 7,4 × 10 -12 și 2,2 × 10 -6, respectiv). Aceste date indică faptul că factorul de oțel este necesar pentru motilitatea PGC activă înainte de a intra în intestinul posterior.

Agregarea PGC în embrioni mutanți din oțel nu se datorează reglării în sus a E-cadherinei. (Sus) E-cadherină (roșie) și PGC (verde) în embrioni Steel +/+ E7.5, individual și combinat. (Partea de jos) Aceeași colorare, dar pentru embrioni din oțel -/-. Nici o diferență în expresia E-cadherinei nu a fost observată în diferite genotipuri de oțel. Bare de scară: 50 μm.

Pierderea unei alele a lui Bax nu salvează motilitatea PGC. Viteza și deplasarea PGC-urilor în filme din embrionii Steel +/+, Steel +/- și Steel -/- cu și fără pierderea unei alele Bax au fost analizate ca în Fig. 4. Nu s-au observat diferențe semnificative statistic în motilitatea PGC la embrionii din oțel -/- atunci când s-a pierdut o alelă a lui Bax. n, numărul de PGC utilizate pentru cuantificare. Unitățile de pe axa y variază în funcție de parametru și sunt indicate sub diagramele de bare.

Interesant este că PGC-urile din embrionii din oțel -/- nu au reușit nici să se îndepărteze unul de celălalt și au format în schimb grupuri în regiunea proximală a alantoidei (Fig. 4A, B). Pentru a cuantifica acest lucru, grupurile au fost definite ca aglomerări care conțin mai mult de trei PGC, iar acestea au fost marcate în cadrele punctului final din filmele E7.5 ale fiecărui genotip (Fig. 4H). Aproape 58,3% din PGC-urile embrionilor din oțel -/- erau în grupuri, comparativ cu 18,7% în embrionii din oțel +/+ (P = 6,4 × 10 -5). Pierderea unei alele a oțelului a crescut, de asemenea, numărul de PGC grupate comparativ cu colegii Steel +/+ (30,8%, P = 0,0003). Glicoproteina de adeziune E-cadherină a fost raportată anterior ca fiind exprimată de PGC (Okamura și colab., 2003; Bendel-Stenzel și colab., 2000). Pentru a testa dacă aglomerarea PGC se datorează expresiei precoce a E-cadherinei, am colorat embrioni de tip sălbatic și din oțel -/- la E7.5 ca monturi întregi cu anticorpul ECCD2 împotriva E-cadherinei (Shirayoshi și colab., 1986). E-cadherina nu a fost suprareglementată de PGC în embrioni din oțel -/- în această etapă (Fig. 5A). Este posibil ca expresia altor molecule de aderență să fie responsabilă de aglomerarea și de motilitatea eșuată. Cu toate acestea, alte molecule de aderență nu au fost încă caracterizate în celulele germinale migratoare timpurii.

Pentru a exclude posibilitatea ca eșecul motilității PGC să se fi datorat apoptozei, am analizat viteza maximă și medie și deplasările totale ale PGC în embrionii E7.5 din oțel -/-, Bax +/-. Pierderea unei alele de Bax salvează numărul de celule germinale (Fig. 3), dar nu salvează motilitatea celulelor germinale (Fig. 6).

Pentru a exclude posibilitatea ca defectele migrației PGC observate la embrionii din oțel -/- să fie consecințele unei cerințe anterioare pentru factorul de oțel înainte de migrarea în alantoidă, am efectuat o blocare "acută" a semnalizării factorului de oțel prin cultivarea bisectată E7.5 Embrioni din oțel +/+ în prezența anticorpului Ack2, care s-a dovedit că blochează în mod eficient funcția de semnalizare a oțelului și a factorului de oțel în PGC (Nishikawa și colab., 1991; Runyan și colab., 2006; Stallock și colab., 2003). Așa cum se arată în FIG. 7, atât viteza cât și deplasarea PGC-urilor au fost semnificativ reduse prin tratament cu 10 μg/ml Ack2 timp de 6 ore în comparație cu cei din embrionii martori (embrionii P -/- nu s-au datorat unei cerințe anterioare pentru factorul Oțel (de exemplu, în specificația PGC).

Factorul oțel este necesar pentru motilitatea PGC în intestinul posterior

La embrionii din oțel -/- examinați, numerele PGC au fost deja reduse (~ 40% din numerele de control) la E7.5, sugerând că numerele PGC sunt controlate de factorul Oțel imediat ce apar în embrion. Aceasta este aproape sigur o interacțiune directă, deoarece doar PGC-urile exprimă c-Kit în alantoidă în acest stadiu (Yabuta și colab., 2006). Reducerea numărului de PGC în absența factorului Steel ar putea fi cauzată în trei moduri: creșterea apoptozei, scăderea proliferării sau defecte în specificațiile PGC. Numărul scăzut de PGC în această etapă face extrem de dificilă analiza statistică a colorării PARP clivate (moartea celulei) sau a colorării fosfo-histonei H3 (mitoză). Cu toate acestea, în cele cinci embrioni examinați până acum, care erau din oțel -/- și Bax +/-, numărul PGC a fost crescut dramatic prin eliminarea unei alele de Bax, ceea ce implică faptul că factorul de oțel nu este necesar pentru specificația PGC, dar este necesar pentru supraviețuirea lor. Acest rezultat nu exclude posibilitatea ca PGC-urile să necesite, de asemenea, factorul Oțel pentru proliferarea lor în acest stadiu. Investigații suplimentare vor fi efectuate într-un fundal Bax-nul pentru a studia rolul factorului Steel asupra proliferării PGC.

Factorul oțel a fost considerat un factor esențial pentru supraviețuirea și proliferarea PGC în studii anterioare. Cu toate acestea, rolul precis jucat de factorul Steel în migrarea PGC nu a fost clar. Aici, arătăm că celulele germinale sunt migratoare activ înainte de colonizarea intestinului și că factorul oțel este necesar pentru motilitatea lor, dar nu și direcționalitatea lor, în acest stadiu. Urmărirea PGC-urilor individuale pe cadre de filmare începând cu E7.5 a arătat că atât viteza, cât și deplasările PGC-urilor au fost semnificativ scăzute la embrionii cu oțel nul. PGC-urile nu au reușit, de asemenea, să se îndepărteze unul de celălalt în embrioni din oțel -/- și au format în schimb grupuri în regiunea proximală a alantoidei extraembrionare. Nu este clar de ce PGC-urile ar trebui să adere între ele fără factorul Steel. Este posibil ca celulele germinale să devină specificate ca grup, iar scăderea motilității să le facă să nu se îndepărteze de grup. Alternativ, factorul oțel poate inhiba expresia proteinelor de adeziune. Blocarea acută a semnalizării factorului Oțel prin cultivarea embrionilor E7.5 bisecați în prezența anticorpului Ack2 a confirmat efectele factorului Oțel asupra motilității PGC în această etapă, demonstrând că defectele de motilitate ale PGC nu sunt consecințe ale unei cerințe anterioare pentru factorul Oțel.

In vitro, folosind camere Boyden modificate, s-a raportat că factorul Steel are o funcție chimiotactică (Farini și colab., 2007). Cu toate acestea, experimentele in vivo descrise aici în două etape, înainte și după colonizarea intestinului posterior, arată că factorul Steel este esențial pentru motilitatea PGC, dar că direcția de mișcare nu este randomizată în absența factorului Steel. Această discrepanță s-ar putea datora altor indicii de ghidare disponibile în absența factorului Steel sau a unei cerințe pentru factorul Steel pentru ghidarea ulterioară în migrarea celulelor germinale, care nu a fost testată aici. La E7.5, în timpul migrației de la alantoidă la epiblastul posterior, direcționalitatea PGC la embrionii Oțel-nuli este puțin modificată. Acest lucru se poate datora faptului că celulele germinale migrează mai lent în acești embrioni și, prin urmare, sunt afectate mai mult de alte mișcări morfogenetice care au loc în acest moment, deși această posibilitate nu a putut fi testată.

Material suplimentar

Note de subsol

Autorii ar dori să mulțumească Fundației de Cercetare a Spitalului de Copii din Cincinnati pentru sprijinul financiar acordat acestui proiect și doctorului Fred Finkelman pentru furnizarea anticorpului Ack2.

    • Acceptat pe 9 februarie 2009.