• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

rezumat

Introducere

(A) Un model de hamster de CCA a fost utilizat pentru a identifica proteinele neregulate la hamsterii cu CCA indusă de Ov și la hamsterii infectați cu Ov (stare „inflamată”). Pentru a provoca CCA experimentală indusă de Ov (grupul „CCA indus de Ov”), hamsterii au fost infectați cu ov metacercariae și li s-a suplimentat dieta cu NDMA. Grupul „infectat cu ov” a fost infectat cu ov, dar nu a primit NDMA; (B) Ficatele hamsterului au fost resecate și iTRAQ și spectrometria de masă tandem au fost utilizate pentru a profila nivelurile de exprimare a proteinelor. Anticorpii pentru cinci proteine ​​au fost apoi folosiți pentru a valida descoperirile iTRAQ atât în ​​țesutul hamster, cât și în cel uman, folosind imunoblotarea și imunohistochimia.

marchează

Proceduri experimentale

Proiectare experimentală și raționament statistic

Au fost efectuate experimente iTRAQ cantitative pe preparate de proteine ​​hepatice întregi din trei grupuri de hamsteri: grupuri „normale”, „CCA induse de ov” și „infectate cu ov” folosind trei replici biologice din fiecare grup. Pentru verificare în țesutul hepatic al hamsterului s-au efectuat experimente Western blot și analize imunohistochimice folosind patru replici biologice din fiecare dintre cele trei grupuri experimentale. Toate țesuturile CCA umane au fost obținute cu consimțământul informat de la pacienții de la spitalul Srinagarind, Universitatea Khon Kaen, Thailanda. Pentru experimentele Western blot în țesutul CCA uman, au fost utilizate șapte replici biologice și în fiecare replică a fost utilizat țesutul non-tumoral adiacent ca control. Proteinele candidate au fost verificate în continuare folosind analiza IHC pe un țesut care conține TMA de la 68 de pacienți cu CCA, 48 de bărbați și 20 de femei. Scopul acestui studiu a fost identificarea potențialilor potențiali pentru studii ulterioare, iar numărul eșantioanelor a fost în principal ghidat de 1) costurile reactivilor; și 2) disponibilitatea eșantionului.

Parazit și țesut animal

Ov metacercariae au fost obținute de la pești ciprinoizi infectați în mod natural în provincia Khon Kaen, Thailanda, folosind metode stabilite [8]. Pe scurt, peștii au fost digerați cu 0,25% pepsină-HCI și metacercariae izolate din suspensia rezultată. Metacercariae au fost examinate microscopic, s-au folosit chisturi numărabile și viabile pentru infectarea hamsterilor (Mesocricetus auratus). Toate probele de țesut animal au fost prelevate de la hamsteri utilizați într-un studiu imunohistochimic al CCA indus de Ov descris în [8] și aprobat de Comitetul de etică animală al Universității Khon Kaen, Thailanda (AEKKU 22/2557). Proiectul experimental este prezentat în Fig. 1A. Hamsterii au fost întreținuți la unitatea de cercetare a animalelor de la Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen, utilizând protocoale aprobate de Comitetul de Etică Animală al Universității Khon Kaen.

CCA indusă de ov la hamsterii aurii sirieni

Doisprezece hamsteri de aur masculi sirieni (Mesocricetus auratus) cu vârsta cuprinsă între 4-6 săptămâni au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupe de patru animale: 1.) grupul „Normal”, care a primit o dietă convențională murină (CP-SWT, Thailanda); 2.) grupul „CCA indus de ov”, care a fost infectat cu 50 ov metacercariae prin inoculare orală și a alimentat dieta de control suplimentată cu NDMA în primele două luni ale studiului (administrat în apă disponibilă ad libitum la 12,5 ppm); și 3.) grupul „infectat cu ov”, care a fost infectat cu 50 ov metacercariae prin inoculare orală și a alimentat dieta de control.

Țesutul pacientului

Țesuturile hepatice umane au fost preparate așa cum este descris în [14]. Consimțământul informat scris a fost obținut de la 68 de pacienți cu CCA, 48 de bărbați și 20 de femei, care au suferit o rezecție hepatică la spitalul Srinagarind, Universitatea Khon Kaen, Thailanda în perioada 1999-2010 (HE571283). Pacienții au avut o vârstă medie în ani de 57 ± 7,7 (38-74 ani). Comitetul de etică pentru cercetarea umană, Universitatea Khon Kaen, a aprobat protocoalele de studiu pentru obținerea probelor de ficat din biobancă a Centrului de Cercetare pentru Fluke și Colangiocarcinom hepatic (HE571294). Țesutul hepatic înghețat din șapte cazuri de tumori asociate (non-tumorale și tumorale adiacente) au fost utilizate pentru Western blot și țesuturile hepatice încorporate în parafină din aceleași cazuri au fost utilizate pentru analiza imunohistochimică. Microarraysurile de țesuturi (TMA) au fost construite de către Departamentul de Patologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen, așa cum s-a descris anterior [15]. TMA-urile conțineau 68 de cazuri de CCA umane. Pentru a confirma prezența țesutului tumoral intact, o secțiune colorată cu H&E a blocului TMA a fost pregătită și revizuită de doi patologi independenți. Diagnosticul pacienților cu CCA a fost evaluat prin date clinice, analiza imagistică, markeri tumorali și patologie.

Purificarea proteinelor din ficatul hamsterului

Țesutul hepatic de hamster (100 mg) din fiecare hamster din fiecare grup a fost suspendat în 600 ofl de tampon de liză (7M uree, 2M tiourea, 4% (greutate/volum) CHAPS și 40 mM Tris-Base) și omogenizat cu un omogenizator cu microtuburi la 4 ° C timp de 5 min. Proba a fost sonicată timp de 1 min și incubată pe gheață timp de 30 min. Probele solubilizate au fost centrifugate la 12.000 × g timp de 20 minute la 4 ° C. Probele de proteine ​​au fost precipitate cu 6 volume de acetonă rece la -20 ° C peste noapte. Proteinele au fost apoi peletizate folosind centrifugarea la 8.000 × g la 4 ° C timp de 10 min și peletele resuspendate în bicarbonat de trietilamoniu 0,5M (TEAB) pH 8,5 (Sigma-Aldrich) și 0,1% SDS. Proteinele au fost cuantificate prin testul proteinei Bradford (Bio-Rad) folosind recomandările producătorilor.

Reducere, alchilare și etichetare iTRAQ

Proteinele hepatice totale din trei replici biologice au fost analizate în trei experimente iTRAQ. Proteinele hepatice (100 pg) de la trei hamsteri din fiecare grup au fost reduse, alchilate și marcate folosind iTRAQ 8PLEX Multiplex Kit (AB Sciex, SUA). Pe scurt, probele de proteine ​​au fost reduse cu 10 mM ditiotreitol la 60 ° C timp de 1 oră și alchilate în 50 mM iodoacetamidă sau metil metaniosulfonat (MMTS) la 37 ° C timp de 30 min. Proteinele au fost apoi digerate cu 2 ug de tripsină la 37 ° C timp de 16 ore. Reactivii de marcare iTRAQ au fost preparați prin adăugarea a 50 pl de izopropanol la fiecare flacon și aceștia au fost apoi folosiți pentru a marca probele de peptide timp de 2 ore la temperatura camerei. Peptidele marcate au fost combinate în trei amestecuri, reprezentând trei replici biologice, fiecare conținând patru probe de peptide („CCA indusă de Ov”, „infectată cu Ov” și două canale de control). După etichetare, amestecurile de peptide au fost curățate folosind coloane de schimb ionic HiTrap (GE Healthcare) și desalinizate folosind un cartuș Sep-Pak Vac C18 (Waters, SUA). Fracțiile curățate au fost apoi liofilizate înainte de OFFGEL ™ .

Fracționarea OGE

Fracționatorul 3100 OFFGEL și kitul OFFGEL pH 3-10 (Agilent Technologies, Germania) cu o configurație cu 24 de godeuri au fost pregătite conform protocoalelor producătorului. Amestecurile de peptide liofilizate au fost diluate la un volum final de 3,6 ml folosind soluția de probă de peptidă OFFGEL. Fâșiile de gel IPG (24 cm) cu un interval de pH liniar de 3-10 (GE Healthcare, Germania) au fost rehidrate cu soluția de rehidratare a benzii peptidice IPG conform protocolului producătorului și 150 ofl de probă au fost încărcate în fiecare godeu. Peptidele au fost focalizate izoelectric cu un curent maxim de 50 uA până când s-au atins 50 kV-h. Douăzeci și patru de fracții au fost recuperate din fiecare godeu și godeurile au fost clătite cu 150 ofl de apă/metanol/acid formic (49/50/1) timp de 15 min. Fiecare fracție a fost liofilizată și apoi resuspendată în 15 ofl de H2O cu 5% (v/v) acid formic înainte de analiza LC-MS/MS.

Izolarea și purificarea exosomilor din linia celulară KKU055

Evaluarea prezenței și purității exosomilor

Microscopia electronică a fost utilizată pentru a identifica fracțiile care conțin exosomi și pentru a confirma puritatea exosomilor în preparatele de exosomi. O alicotă de 2 alil din fiecare dintre probele de exosomi din fracțiuni cu gradient de densitate în soluție de Tris-HCI (pH 7,5) a fost adsorbită direct pe rețelele de cupru acoperite cu carbon formvar, descărcate pe strălucire, pe lamele SuperFrost (AgarScientific, Marea Britanie) pentru a obține un monostrat de exosomi. pentru analiză. Fiecare lamă a fost apoi colorată negativ cu acetat de uranil 2% proaspăt preparat în suspensie apoasă. Grilele au fost uscate la aer timp de 3 minute și au fost realizate cu ajutorul unui microscop electronic cu transmisie JEM-100CX (JEOL, Japonia) echipat cu un filament termionic de tungsten și acționat la o tensiune de accelerație de 100 kV. Imaginile digitale au fost realizate cu o dimensiune a pixelilor de 0,3 nm folosind o cameră Olympus Morada folosind timpi de expunere între 100 și 400 mS.

Purificarea proteinelor exozomice și SDS-PAGE

Exosomii izolați au fost rezolvați în 1 ml 1xPBS și centrifugați la 100.000xg timp de 60 min la 40 ° C pentru a peleta exosomii. Peleta a fost resuspendată în 200 ofl de tampon de resuspendare pentru exosom rece (Ghid de izolare totală ARN și kit de izolare a proteinelor, Invitrogen). Proba a fost incubată timp de 5-10 minute la temperatura camerei pentru a permite dizolvarea peletei. Aceasta a fost urmată de pipetarea ușoară a probei pentru a se asigura că peleta a fost complet dizolvată. Precipitarea cu acetonă a fost efectuată prin adăugarea unui volum de acetonă 1: 5 și incubarea peste noapte la -20 ° C. Probele au fost apoi centrifugate la 3000 rpm timp de 15 minute la 40 ° C. Supernatantul a fost aruncat și peleta a fost spălată din nou cu acetonă și centrifugată la 10.000 rpm timp de 15 minute la 40 ° C. Peleta a fost dizolvată în 10 ofl de tampon laemmli și incubată la 96 ° C timp de 3-5 min. Această soluție a fost încărcată pe gel împotriva scării (Precision Plus Protein ™ Dual Color Standards) și supusă SDS-PAGE și digestie în gel.

Spectrometrie de masă tandem

Căutări spectrale și analize bioinformatice

(A) Spectru reprezentativ din spectrometria de masă în tandem a proteinelor hepatice de hamster cu ioni reporter utilizați pentru cuantificare (inserție); (B) Eficiența etichetării a fost evaluată utilizând căutări specificând etichetele iTRAQ ca modificări variabile; (C) În fiecare replică iTRAQ, două alicote ale aceluiași eșantion de control au fost etichetate cu ioni reporter diferiți și utilizate ca validare internă a raporturilor de expresie.

Proteine ​​neregulate în timpul infecției cu Ov și CCA indusă de Ov

Proteine ​​selectate identificate ca fiind neregulate în ficatul hamsterilor cu CCA indusă experimental și hamsterii infectați cu Ov. Abrevieri utilizate: Neutilizat - Scorul ProteinPilot pentru identificarea proteinelor; SC - numărul de peptide unice utilizate pentru identificarea proteinelor; Expr. CCA - modificarea ori a proteinei în comparație cu proba de control normală; Expr. Ov infectat - modificarea relativă a pliurilor în comparație cu proba de control normală.

Validarea datelor iTRAQ în țesutul hamster

Pentru a furniza o măsură independentă a expresiei proteinelor în țesutul de hamster, cinci proteine ​​au fost selectate pentru imunohistochimie (IHC) și experimente de imunoblotare pe baza 1.) puterii neregulării lor și 2.) semnificației funcționale a proteinei. În grupul „CCA indus de ov”, imunoblotarea a cinci proteine ​​(S100A6, lumican, plastină-2, 14-3-3 zeta/delta și vimentină) au prezentat același profil de expresie observat în experimentele iTRAQ (Fig. 4A și B) . În grupul „infectat cu ov”, patru proteine ​​(prolargină, plastină-2, 14-3-3 zeta/delta și vimentină) au prezentat, de asemenea, același profil de expresie în experimentele de imunoblotare, așa cum a fost observat în experimentele iTRAQ (datele nu sunt prezentate) . În experimentele IHC folosind țesut tumoral gradat din grupul „CCA indus de Ov”, expresia S100A6, lumican, plastin-2 și 14-3-3 zeta/delta a fost observată în citoplasma tumorii căilor biliare, în timp ce vimentina a fost găsită în principal în citoplasma fibroblastelor la fibroza periductală și stroma tumorală (Fig. 4C). Încă o dată, expresia proteinelor reflectă cea observată în experimentele iTRAQ (Fig. 4C și D).

Modificările exprimării a cinci proteine ​​(S100A6, lumican, plastin-2, 14-3-3 zeta/delta și vimentină) au fost evaluate prin Western blot și colorare imunohisto-chimică a țesutului uman. (A) Analiza Western blot în șapte cazuri de tumori pereche (N, non-tumorală adiacentă și T, țesut tumoral); (B) intensitățile relative ale benzii au fost normalizate prin medie normală și reprezentate grafic ca grafice dispersate. Asteriscul (*) denotă o diferență semnificativă (p Proteinele omoloage proteinelor de hamster neregulate în CCA care au fost identificate în exozomi secretați de linia celulară CCA umană KKU055 Douăzeci și șapte de proteine ​​exosomi umani, din 282 identificări totale, s-au dovedit a fi omologi scor> 50) la proteinele neregulate în modelul de hamster al CCA.Acestea au inclus unele dintre cele mai puternic supra-exprimate proteine ​​din ficatul de hamster al hamsterilor cu CCA. În dreapta, micrografia electronică de transmisie a preparatului exosomului utilizat în experimentele de proteomică.

Douăzeci și șapte de proteine ​​ale exosomilor umani, din 282 de identificări totale, s-au dovedit a fi omologi (scor de biți BLAST> 50) față de proteinele neregulate în modelul de hamster al CCA. Acestea au inclus unele dintre cele mai puternic supra-exprimate proteine ​​din ficatul de hamster al hamsterilor cu CCA. În partea dreaptă, micrografia electronică de transmisie a preparatului exosomului utilizat în experimentele de proteomică.

Discuţie

30% din cazurile de CCA asociate cu Ov. În studiul actual, am folosit tehnici proteomice avansate (marcare izobarică și spectrometrie de masă tandem) pe animale în etapele distincte ale tranziției de la infecția cu ov la CCA indusă de ov pentru a identifica un număr mare de markeri potențiali pentru CCA asociate cu ov care ar putea distinge, de asemenea, CCA asociată cu ov de inflamația care însoțește infecția cronică cu ov la omul rezident în zonele endemice ale ovului și care ar putea fi evaluată în continuare pentru aplicarea lor ca markeri diagnostici ai CCA.

În general, colangiocarcinogeneza este asociată cu o gamă largă de modificări celulare care se reflectă în profilul de exprimare a proteinelor din țesutul tumoral. În studiul actual, am utilizat un model robust de hamster de CCA indusă de Ov pentru a profila aceste profiluri de exprimare a proteinelor folosind metode cantitative de proteine ​​iTRAQ și spectrometrie de masă tandem pentru a identifica markeri potențiali în tranziția de la infecția cu Ov la CCA asociată cu Ov. Folosind etichetarea izobarică, am identificat peste 200 de proteine ​​neregulate care pot informa acum eforturile viitoare de a dezvolta un biomarker pentru diagnosticul CCA asociate cu Ov. Expresia excesivă a cinci proteine ​​a fost confirmată în țesutul de hamster și, mai important, trei dintre aceste cinci proteine ​​au fost apoi confirmate ca supra-exprimate în țesutul tumoral asociat cu Ov uman. Ultima observație sugerează că proteinele supra-exprimate identificate în modelul de hamster al CCA indus de Ov pot fi, de asemenea, supra-exprimate în CCA asociat cu Ov uman. Luate împreună, aceste date oferă o bază pentru eforturile viitoare de a dezvolta biomarkeri și terapeutice potențiale pentru diagnosticul și tratamentul CCA asociate cu ov, precum și a altor tipuri de cancer legate de infecții.