Vezi Eun Kim

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

Tae Hyun Kim

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

Parcul Shin Ae

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

A câștigat Tae Kim

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

Young Woo Park

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

Jae Sang Ahn

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

Manbok Jeong

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

Min-Young Kim

2 AngioLab, Inc. Daejeon 34016, Coreea.

Kangmoon Seo

1 Departamentul de Chirurgie Veterinară, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Seoul, Seul 08826, Coreea.

Abstract

Introducere

Bolile parodontale sunt cauzate de colonizarea bacteriană parodontală (placa) și de stimularea răspunsurilor imune ale gazdei datorate subproduselor bacteriene [1]. Mai mulți cercetători au demonstrat că modularea farmacologică a răspunsurilor inflamatorii și imune exagerate ale gazdei, pe lângă eliminarea microbiană, este benefică în tratamentul parodontitei [9,23]. S-a raportat că metaloproteinazele matriciale (MMP) au roluri importante în proteoliza componentelor matricei extracelulare [4]. Sub progresia bolii parodontale, gazda și enzimele proteolitice derivate din microbi mediază degradarea matricei extracelulare [23]. Studii recente au arătat că MMP-2 (gelatinaza A) și MMP-9 (gelatinaza B) pot produce distrugerea țesutului parodontal; în plus, s-a raportat că MMP derivate din leucocite polimorfonucleare (PMN) (MMP-8, MMP-9) sunt principalele proteinaze implicate în distrugerea și remodelarea țesutului parodontal [5,11,18]. Alte studii au arătat că probele de lichid crevicular gingival din parodontită conțin MMP-13, care nu a fost găsit în probele din gingia sănătoasă [10]. Astfel, inhibarea MMP-urilor derivate din gazdă poate avea un rol cheie în prevenirea și reducerea progresiei parodontitei.

În medicina populară, produsele de castan de cal (Aesculus hippocastanum L.) și extractele acestora au fost utilizate ca remedii pentru tuse, congestie, artrită și reumatism. În special, extractul de semințe de castan de cal conține aescină, un glicozid acid triterpenic care are efecte antiinflamatoare, antiedematoase, anti-secretoare și tonice [19]. Extractele din semințe de castan de cal sunt disponibile comercial, la nivel mondial, pentru gestionarea insuficienței venoase cronice. Extractele de frunze de castan de cal conțin doar urme de escină, dar sunt bogate în flavonoide, inclusiv quercetină și kaempferol, precum și glicozide flavonolice, cum ar fi quercitrina. Astfel de extracte sunt disponibile comercial pentru injectare și sunt utilizate în tratamentul edemului și insuficienței venoase [2].

Scopul acestui studiu a fost de a evalua efectul clinic al extractului de frunze de castan de cal ALH-L1005 ca inhibitor al MMP asupra progresiei parodontitei la câinii beagle cu parodontită indusă experimental.

Materiale și metode

Protocolul acestui studiu a fost aprobat de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (SNU-080118-2; Universitatea Națională din Seul, Coreea). Toate operațiile experimentale și examinările au fost efectuate sub anestezie generală cu o combinație comercială de zolazepam și tiletamină (5 mg/kg, intramuscular [IM]; Virbac, Franța).

Pregătirea chimică

Frunza de castan de cal (Aesculus hippocastanum L; articolul nr. 38135000) a fost achiziționată de la Kräuter Mix (Germania) și extractul ALH-L1005 preparat după cum urmează: Zece kilograme de frunze de castan de cal uscate au fost extrase cu 200 L de etanol apos 25% pentru 2 h și filtrat. Filtratele au fost concentrate sub vid și uscate pentru a obține 1,73 kg ALH-L1005. ALH-L1005 obținut a fost standardizat cu compusul de referință utilizând cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Pentru administrare orală, s-au format 150 mg capsule de extract ALH-L1005.

Analiza MMP a ALH-L1005

Pentru a stabili cea mai eficientă formulă, activitățile inhibitoare ale MMP ale doxiciclinei, extractului din semințe comerciale (Finzelberg, Germania), extractului din frunze comerciale (Dr. Willmar Schwabe, Germania) și ALH-L1005 au fost estimate experimental. Înainte de testul MMP, MMP-2 și MMP-9 recombinante umane (R&D Systems, SUA) au fost activate cu 1 mM APMA. Activitățile MMP au fost măsurate pe un spectrofluorometru (Perkin-Elmer, SUA) folosind 2,4-dinitrofenil-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg (Calbiochem, SUA) ca substrat. MMP (10 nM) și substratul (1 μM) au fost amestecate în 2 mL tampon de reacție (50 mM Tricină, pH 7,5, 10 mM CaCl2, 200 mM NaCl) împreună cu fiecare material de testat. Intensitatea fluorescenței a fost măsurată la temperatura camerei folosind o lungime de undă de excitație de 280 nm și o lungime de undă de emisie de 360 ​​nm.

Pregătirea gingiei sănătoase

Șaisprezece câini beagle, în vârstă de aproximativ 1,5 ani, au fost folosiți pentru studiu. Toți dinții fiecărui beagle au fost scalați și lustruiți. În următoarea perioadă de 2 săptămâni, periajul dinților a fost efectuat de două ori pe zi fără anestezie pentru a obține starea parodontală optimă. În aceste 2 săptămâni, beagle-urile au fost hrănite cu o dietă dură de tip pelet pentru a menține sănătatea gingivală prin reducerea potențialului de formare a plăcii [20].

Parodontita indusă experimental

După pregătirea gingivei sănătoase, parodontita experimentală a fost indusă după cum urmează: Suturile folosind 2-0 mătase (Ailee, Coreea) cu sârmă ligatură dentară (ClassOne Orthodontics, SUA) au fost legate în jurul regiunii cervicale a PM2, PM3 și PM4 dreapta superioare, și dinții inferiori din dreapta PM3, PM4 și M1. Periajul dinților a fost oprit după ligare și alimentele moi umede au fost administrate timp de 8 săptămâni. Dinții care au fost dezlegați în decurs de 8 săptămâni au fost excluși din studiu. Ligaturile au fost îndepărtate după perioada de inducție a parodontitei, iar câinii au fost împărțiți aleatoriu în 4 grupe: control negativ (NC; numai excipient), control pozitiv (PC; doxiciclină; DongKoo Bio & Pharma, Coreea), ALH-L1005 doză mică test (LT), și testul ALH-L1005 cu doză mare (HT) (Tabelul 1). Toate medicamentele au fost administrate peroral, de două ori pe zi după 6 săptămâni. După îndepărtarea ligaturii, au fost examinați indicatorii de stare parodontală, inclusiv indicele de placă (PI), indicele gingival (GI), adâncimea parodontală a buzunarului (PPD), nivelul de atașament clinic (CAL) și sângerarea la presiune (BoP). Standardele au fost modificate după cum este rezumat în Tabelul 2 [17,26,31]. Toate măsurătorile au fost luate de un clinician cu experiență (SE Kim) folosind o sondă parodontală codată în culori sterile (Helmut Zepf Medizintechnik, Germania).

tabelul 1

extractului

* 25% extract de alcool apos din frunza de castan de cal (Aesculus hippocastanum L.).

masa 2

* Unii indici de notare au fost modificați din referințele originale. PI, indicele plăcii; GI, indicele gingival; PPD, adâncimea buzunarului parodontal; CAL, nivel de atașament clinic; BoP, sângerare la presiune.

Colectarea și prelucrarea probelor gingivale

La 6 săptămâni după începerea medicației, probele de țesut gingival au fost obținute din marginea gingivală bucală a PM4 dreapta superioară prin intermediul unui pumn de biopsie (Miltex, Germania). Țesuturile colectate au fost spălate imediat în soluție salină normală (0,9% NaCI) pentru a îndepărta resturile, inclusiv placa și sângele, și depozitate congelate la -80 ℃ în tuburi de microcentrifugă codificate până când au fost analizate. Ulterior, țesuturile gingivale au fost decongelate, cântărite și extrase la 4 ℃ cu tampon uree 5 M (20 mg greutate umedă de țesut gingival per 1 ml tampon). Conținutul de proteine ​​din extractele gingivale a fost cuantificat utilizând metoda de testare a acidului bicinchoninic [29].

Zimografie

Activitățile gelatinolitice și cazeinolitice din extractele gingivale au fost determinate prin zimografie. Extractele gingivale au fost amestecate cu tampon de probă zimografică 2 × conținând 63 mM Tris-HCI (pH 6,8), 10% glicerol, 2% sodiu dodecil sulfat (SDS) și 0,0025% albastru de bromofenol fără denaturare termică. Electroforeza a fost efectuată pe geluri SDS-poliacrilamidă 10% conținând 0,1% gelatină și pe geluri SDS-poliacrilamidă 12% conținând 0,25% cazeină la 125 V. După electroforeză, gelurile au fost incubate în tampon de renaturare 2,5% (Sigma-Aldrich, SUA) pentru 30 min la temperatura camerei cu agitație ușoară și apoi echilibrată în tampon de dezvoltare conținând 50 mM bază Tris, 40 mM HCL, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2 și 0,2% Brij 35 timp de 30 min la temperatura camerei cu agitare ușoară. Ulterior, gelurile au fost incubate în tampon de dezvoltare peste noapte la 37 ° C. Gelurile au fost colorate cu 0,1% albastru Coomassie R250 (Sigma-Aldrich, SUA) și colorate cu 10% acid acetic în 40% metanol. Standardele MMP-2 și -9 umane au fost rulate pe gel pentru zimografie pe gelatină și pe standard MMP-13 pentru zimografie cu cazeină ca martori pozitivi.

analize statistice

Toate datele au fost analizate statistic utilizând software-ul SPSS (ver. 21.0; SPSS, SUA). Modificările tuturor parametrilor parodontali din săptămâna 0 până în săptămâna 6 în cadrul fiecărui grup au fost evaluate prin testul t al Studentului asociat. Pentru comparația intergrup, valorile din săptămânile 0 și 6 au fost analizate prin analiza unică a varianței (ANOVA). Testul lui Dunnett a fost folosit ca test post hoc. Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

Rezultate

Activități inhibitoare MMP ale ALH-L1005

Activitatea inhibitoare a MMP a ALH-L1005 a fost comparată cu cele ale altor extracte de castan de cal și doxiciclină (Tabelul 3). La aceleași concentrații, ALH-L1005 a prezentat o inhibare mai mare a MMP-2 (88,50%) decât inhibarea cu 18,51% a extractului comercial din semințe de castan de cal (Finzelberg, Germania) și inhibarea cu 49,98% a extractului din frunze de castan comercial pentru injectare (Dr. Willmar Schwabe). În plus, ALH-L1005 a prezentat o inhibiție excelentă a MMP-9 (91,84%), comparativ cu inhibițiile de 27,48% și 55,73% ale extractului comercial de semințe și respectiv extractului de frunze comercial pentru injecție. În comparație cu doxiciclina, ALH-L1005 a avut niveluri de activitate inhibitoare similare față de MMP-2 și MMP-9.

Tabelul 3

* 25% extract de alcool apos din frunza de castan de cal (Aesculus hippocastanum L.). † Extract sub formă de pudră de semințe de castan de cal (Finzelberg). ‡ Venoplant (Dr. Willmar Schwabe).

Starea parodontală

După perioada de inducție de 8 săptămâni, parodontita a fost indusă semnificativ pe dinții experimentali comparativ cu cea pe dinții netratați. Ligaturile plasate pe regiunea cervicală au dus la progresia inflamației gingivale cauzată de o acumulare de placă cu resturi alimentare. Dintre cei 96 de dinți legați de ligături de mătase și sârmă, 70 au continuat ligarea la sfârșitul perioadei de inducție și au fost incluși în analiza statistică. Numărul de dinți incluși în fiecare grup a fost după cum urmează: NC (n = 14), PC (n = 14), LT (n = 22) și grupul HT (n = 20).

Tabelul 4

* Diferența semnificativă statistic în comparație cu scorul inițial (p Fig. 1 arată o comparație intergrup a parametrilor clinici înainte și după perioada de studiu de 6 săptămâni. Valorile inițiale ale tuturor parametrilor clinici din grupurile PC, LT și HT nu au fost semnificativ diferite din cei din grupul NC (p> 0,05; Fig. 1). În săptămâna 6, scorurile PI și BoP ale grupurilor LT și HT au fost semnificativ mai mici comparativ cu cele din grupul NC (p Fig. 1). În mod similar, Scorurile GI ale grupurilor PC, LT și HT au fost, de asemenea, semnificativ scăzute în comparație cu cele ale grupului NC în săptămâna 6 (p Fig. 1).

Activitatea inhibitoare a MMP în țesutul gingival

Zimogramele de gelatină au arătat că grupul NC conținea activitate gelatinolitică în benzi la 92 kDa, care este aceeași zonă de greutate moleculară ca cea din standardele MMP-9 umane. Grupul NC a prezentat benzi la 82 kDa, după cum se arată în pro-MMP-9. Cu toate acestea, benzile similare nu au fost detectate în probele din grupurile PC și HT și au fost detectate doar slab în grupul LT (panoul A din Fig. 2). Niciunul dintre grupuri nu a prezentat benzi gelatinolitice în zona care indică MMP-2.

Similar cu rezultatele gelatinei, zimogramele de cazeină au arătat că probele din grupul NC au exprimat activitate cazeinolitică în benzi la 48 kDa, la fel ca zona benzii pentru standardele MMP-13, în timp ce benzile din grupurile PC și LT au fost detectate doar slab. . În eșantioanele grupului HT, banda a fost abia detectabilă.

Discuţie

Prezentul studiu a fost conceput pentru a identifica eficacitatea clinică a ALH-L1005 în parodontită. În acest studiu, semnele clinice ale parodontitei au fost rezolvate semnificativ în grupurile medicamentoase cu ALH-L1005. Grupurile LT și HT au prezentat scăderi semnificative în scorurile PI, GI, CAL și BoP comparativ cu cele ale grupului NC în săptămâna 6, deși variația CAL a grupului HT nu a atins semnificația statistică. În plus, grupul NC a prezentat o scădere a PPD concomitent cu un increment CAL, în timp ce celelalte grupuri au prezentat scoruri CAL reduse în perioada experimentală. Aceste rezultate indică faptul că scăderea PPD în grupul NC poate fi considerată recesiune gingivală după inflamația parodontală fără ameliorarea parodontitei. Acest studiu a arătat că tratamentul cu ALH-L1005 a îmbunătățit clinic starea parodontală generală comparativ cu cea din grupul de control.

Numeroase studii au investigat modularea răspunsului gazdei pentru tratamentul bolilor parodontale, inclusiv studii asupra inhibitorilor MMP, cum ar fi analogii tetraciclinei și antiinflamatoarele nesteroidiene [23]. În special, o doză subantimicrobiană de doxiciclină a fost recunoscută ca un tratament eficient pentru parodontita care ar putea fi aplicată clinic pentru modularea farmacologică a MMP. Cu toate acestea, doxiciclina a avut efecte secundare, cum ar fi tulburări gastrointestinale, reacții de fotosensibilitate și, rareori, hepatotoxicitate. În plus, este contraindicat în timpul sarcinii sau al copilăriei din cauza posibilității de a întârzia dezvoltarea scheletului fetal și a decolorării dinților [16,22]. Agenții antiinflamatori nesteroidieni au avut, de asemenea, efecte adverse, cum ar fi hemoragia gastrointestinală și hepatopatia [22].

Deoarece farmacodinamica lor a fost analizată, un număr din ce în ce mai mare de agenți antiinflamatori derivați din extracte naturale se aplică în clinicile moderne. Studiile anterioare pe bază de plante au arătat că extractul de Zea mays L., extractul de scoarță de Magnolia obovata thunberg și extractele de avocado/soia nesaponificabile sunt tratamente eficiente pentru boala parodontală [3,14,27]. Extractul de semințe de castan de cal conține agenți antiinflamatori, cum ar fi aescina și flavonoidele, dar conține și aesculină glicozidică care poate avea efecte toxice [6]. Frunzele castanului de cal conțin cantități mai mici de aescină și aesculină decât semințele, dar o cantitate mai mare de flavonoide bogate, inclusiv quercetină și kaempferol, precum și glicozide de flavonol, cum ar fi quercitrina, care au efectul suplimentar de scădere a diferențierii osteoclastice [2,19, 30].

Secvența din cadrul răspunsului inflamator al gazdei la boala parodontală a fost bine descrisă în studiile anterioare [8,21,23,24]. Și există mai multe tipuri de MMP, cum ar fi MMP-1, 2, 3, 8, 9 și 13, implicate în răspunsuri inflamatorii care au fost detectate în probele de țesut și lichid crevicular gingival din gingia inflamatorie [7,10,12, 18,23,25,28]. În acest studiu in vitro, ALH-L1005 a arătat efecte de inhibare a MMP-2 și MMP-9 semnificativ mai bune decât extractele din semințe de castan de cal și din frunze disponibile în comerț. În plus, comparativ cu doxiciclina, care inhibă MMP-2 și MMP-9, ALH-L1005 a produs un nivel de activitate inhibitorie similar.

Pe baza rezultatelor, se sugerează că extractul de frunze de castan de cal ALH-L1005 ar fi eficient în tratamentul clinic al parodontitei și ar oferi o eficacitate similară sau mai bună ca cea a tratamentului cu doxiciclină la câini. În plus, se consideră că efectele antiinflamatorii ale ALH-L1005 acționează printr-un mecanism legat de inhibarea MMP-9 și MMP-13 în țesutul parodontal. Astfel, ALH-L1005 ar putea fi un tratament eficient pentru parodontita la câini și ar putea fi aplicat parodontitei umane după investigații suplimentare privind siguranța și eficacitatea acesteia.

Mulțumiri

Acest studiu a fost susținut financiar de AngioLab, Inc. și a fost susținut de un program Brain Korea 21 pentru științe veterinare și prin Institutul de cercetare pentru științe veterinare (RIVS), Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională din Seul, Coreea.