Shi Yin Foo

o divizie cardiovasculară a Centrului Medical Beth Israel Deaconess Medical Institute CardioVascular și Harvard Medical School, Boston, MA 02215;

b Spitalul General din Massachusetts și Școala de Medicină Harvard, Boston, MA 02114; și

Eric R. Heller

b Spitalul General din Massachusetts și Școala de Medicină Harvard, Boston, MA 02114; și

Joanna Wykrzykowska

o divizie cardiovasculară a Centrului Medical Beth Israel Deaconess Medical Institute CardioVascular și Harvard Medical School, Boston, MA 02215;

Christopher J. Sullivan

o divizie cardiovasculară a Centrului Medical Beth Israel Deaconess Medical Institute CardioVascular și Harvard Medical School, Boston, MA 02215;

Jennifer J. Manning-Tobin

b Spitalul General din Massachusetts și Școala de Medicină Harvard, Boston, MA 02114; și

Kathryn J. Moore

b Spitalul General din Massachusetts și Școala de Medicină Harvard, Boston, MA 02114; și

Robert E. Gerszten

b Spitalul General din Massachusetts și Școala de Medicină Harvard, Boston, MA 02114; și

Anthony Rosenzweig

o divizie cardiovasculară a Centrului Medical Beth Israel Deaconess Medical Institute CardioVascular și Harvard Medical School, Boston, MA 02215;

c Harvard Stem Cell Institute, Cambridge, MA 02138

Contribuțiile autorului: S.Y.F. și A.R. cercetare proiectată; E.R.H., J.W., C.J.S., J.J.M.-T. și K.J.M. cercetări efectuate; R.E.G. a contribuit cu noi reactivi/instrumente analitice; S.Y.F., K.J.M., R.E.G. și A.R. date analizate; și S.Y.F. și A.R. a scris ziarul.

Date asociate

Abstract

Boala vasculară rămâne o cauză dominantă de morbiditate și mortalitate în toată lumea. Cea mai frecventă formă de boală vasculară este ateroscleroza, o afecțiune cronică marcată de acumularea de lipide și materiale fibroase în peretele vasului, care poate culmina cu leziuni tisulare ischemice (1). Se crede că ateroscleroza se formează ca răspuns inflamator la o varietate de stimuli, inclusiv lipide serice care induc disfuncții endoteliale și duc la recrutarea vasculară a leucocitelor (2). Leziuni similare au fost generate într-o varietate de modele animale prin creșterea grăsimilor și colesterolului din dietă (3, 4). Lucrările recente au ridicat posibilitatea ca celulele progenitoare endoteliale (EPC) să ajute la restabilirea funcției vasculare normale (5, 6). În concordanță cu această ipoteză, studiile clinice sugerează că numărul EPC se corelează cu reactivitatea arterei brahiale (7) și invers cu riscul cardiovascular evaluat prospectiv (8). Cu toate acestea, rolul precis al EPC în aterogeneză rămâne slab definit. În schimb, EPC sunt mai clar implicate în îmbunătățirea neovascularizării ca răspuns la ischemia tisulară la adulți (6, 9), o componentă cheie a procesului de vindecare după o astfel de leziune.

Epidemia crescândă de obezitate și îngrijorările legate de complicațiile acesteia, inclusiv bolile vasculare aterosclerotice, au determinat interesul pentru intervenții precum dietele cu conținut scăzut de carbohidrați. De obicei, o reducere a carbohidraților din dietă este însoțită de o creștere a grăsimilor și a proteinelor din dietă, ceea ce susțin susținătorii ar putea avea efecte salutare printr-o reducere netă a încărcăturii glicemice. Într-adevăr, studiile randomizate sugerează că dietele cu conținut scăzut de carbohidrați pot accelera pierderea în greutate, cu un efect negativ surprinzător asupra markerilor serici ai riscului cardiac, cum ar fi colesterolul (10, 11). Mai mult, un studiu recent efectuat la șoareci a demonstrat că o dietă ketogenică extrem de scăzută în carbohidrați a indus pierderea în greutate disproporționată față de reducerea aportului caloric prin inducerea FGF21 hepatic (12). În contrast, un studiu clinic recent a demonstrat că o dietă cu conținut scăzut de carbohidrați a afectat reactivitatea vasculară mediată de flux în comparație cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi, chiar și în condiții de scădere în greutate similară și scăderi ale tensiunii arteriale (13). Cu toate acestea, întrebarea clinică centrală - modul în care astfel de diete afectează sănătatea vasculară pe termen lung - rămâne în mare parte neadresată și am examinat această întrebare în modele murine.

Rezultate

Efectul dietelor LCHP asupra aterogenezei.

diete

Dietele cu conținut scăzut de carbohidrați, bogate în proteine, cresc ateroscleroza la șoarecii ApoE -/-. (A) Suprafața luminală în față a aortelor șoarecilor de la rădăcina aortică până la aorta toracică mijlocie, inclusiv arterele subordonate dreaptă, carotidă stângă și subclaviană stângă. Aortae colorate pentru Oil Red O pentru a delimita leziunile bogate în lipide la 6 și 12 săptămâni pe diete. (B) Zona ateromului ca procent din aria luminală aortică totală (rădăcina aortică până la bifurcația iliacă) la 6 și 12 săptămâni pe dietele indicate. n la 6 săptămâni: SC = 4, WD = 11, LCHP = 11; la 12 săptămâni: SC = 3, WD = 7, LCHP = 7. Rezultatele prezentate ca medie ± SD. Comparații bidirecționale prin testul t Student. (C) Secțiuni histologice ale rădăcinilor aortice la nivelul valvelor aortice colorate cu ulei roșu O la 6 și 12 săptămâni. (D) Cuantificarea secțiunii transversale a leziunilor ateromatoase la nivelul valvei aortice la 6 și 12 săptămâni pe diete. SC, chow standard; WD, „dieta occidentală”; LCHP, cu conținut scăzut de carbohidrați, cu conținut ridicat de proteine. n la 6 săptămâni: SC = 3, WD = 6, LCHP = 6; la 12 săptămâni: SC = 5, WD = 7, LCHP = 7. Rezultatele prezentate ca medie ± SD. Comparații bidirecționale prin testul t Student.

Influența dietelor LCHP asupra markerilor de risc cardiovascular.

Pentru a înțelege baza creșterii aterosclerozei la șoareci hrăniți cu LCHP, am examinat serurile pentru markeri recunoscuți ai riscului cardiovascular (Tabelul 1). După cum era de așteptat, WD a dus la o creștere a colesterolului total seric (1.470 ± 171 mg/dl) comparativ cu dieta SC (359 ± 28 mg/dl, P Tabelul 1). În concordanță cu observațiile clinice (10, 11), colesterolul total seric nu a fost diferit pe LCHP (1.408 ± 251 mg/dL) comparativ cu WD, dar semnificativ mai mare decât controlul SC (P Fig. 2 A). În mod similar, nivelurile de trigliceride, insulină de post și glucoză nu au diferit între șoarecii alimentați cu WD și LCHP (Tabelul 1).

tabelul 1.

Markeri serici ai riscului cardiovascular după 6 săptămâni pe diete

Concentrația serică SCWDLCHP
Colesterol total (mg/dL)358,7 ± 28,31470 ± 170,7 * 1408 ± 251,2 *
Trigliceride (mg/dL)108,0 ± 6,995 ± 27,8155 ± 60,7
Acizi grași neesterificați (mEq/dl)0,55 ± 0,160,86 ± 0,161,40 ± 0,26 *, **
Glucoza (post; mg/dL)136 ± 6,9185 ± 20,5142 ± 17,7
Glucoza (nedorita; mg/dL)N/A406,9 ± 58,9274,2 ± 51,0 **
Insulină (ng/ml)307,5 ​​± 322,2432,9 ± 477,9308,5 ± 205,4

*, Șoarecii P -/- la 6 săptămâni sunt afișați în Dreapta și cuantificați ca procent din zona leziunilor din Stânga. Date cumulative prezentate din trei experimente independente. (n) WD = 11, LCHP = 11. Rezultatele prezentate ca medie ± SD. Toate comparațiile din două grupuri s-au efectuat cu testul t Student.

Nivelurile serice de LDL oxidat (oxLDL) nu au diferit semnificativ între șoarecii hrăniți cu WD și LCHP (2,47 ± 1,7 U/L față de 2,14 ± 1,1 U/L, respectiv), deși ambele diete bogate în grăsimi au prezentat niveluri crescute de oxLDL comparativ cu Șoareci hrăniți cu SC (0,32 ± 0,6 U/L; Fig. 2 B). În plus, etichetarea imunohistochimică cu un anticorp împotriva 8-oxoguaninei, un produs major al stresului oxidativ asupra ADN-ului, a arătat un nivel similar de deteriorare oxidativă în leziunile ateromatoase ale șoarecilor alimentați cu WD și LCHP (Fig. 2 C și Fig. S2 ).

În general, absența diferențelor semnificative în nivelurile de colesterol, glucoză și insulină în repaus alimentar sau nivelurile de oxLDL au sugerat că nici lipidele crescute, dereglarea glucozei și nici stresul oxidativ nu au fost responsabile pentru creșterea aterosclerozei în grupul cu dieta LCHP. În concordanță cu aportul scăzut de carbohidrați, glucoza non-fasting a fost mai mică în grupul LCHP comparativ cu grupul WD (Tabelul 1). Am observat o creștere a nivelului seric al acizilor grași neesterificați (NEFA) în dieta LCHP, deși rolul NEFA în ateroscleroză rămâne neclar. Cu toate acestea, acestea reprezintă un marker clinic de risc (17, 18) care poate crește inflamația (19) care ar putea contribui la aterogeneză.

Inflamația joacă un rol important în aterogeneză. Prin urmare, am examinat nivelurile serice de interleukină-6 (IL-6), un indicator al inflamației generale, care nu a diferit între cele trei cohorte (Fig. 2 D). Chimiochina inflamatorie mai specifică, proteina chimiotratantă monocitară-1 (MCP-1), care este indusă în leziunile ateromatoase, implicată în aterogeneză (20-22) și contribuie la recrutarea monocitelor, a fost semnificativ crescută în serul alimentat cu WD comparativ cu Șoareci hrăniți cu SC (Fig. 2 E). Paradoxal, șoarecii hrăniți cu LCHP au avut niveluri de MCP-1 care erau mai mici decât șoarecii hrăniți cu WD și nu difereau de șoarecii hrăniți cu SC. Lucrările anterioare la modelele de șoareci cu deficiență de MCP-1 la linia germinativă sugerează că această MCP-1 redusă ar trebui, dacă ceva atenuează aterogeneza (21, 22), deși nivelurile serice sunt probabil mai puțin importante decât semnalele inflamatorii locale din peretele vasului. De fapt, examinarea directă a inflamației vasculare prin cuantificarea acumulării leucocitare a plăcii aterosclerotice la șoarecii alimentați cu WD și LCHP nu a evidențiat diferențe în procentele de monocite sau celule T helper în aceste leziuni (Fig. 2 F).

Influența dietelor LCHP asupra celulelor progenitoare endoteliale.

Dieta LCHP reduce actul fosforilat în EPC.

Dieta LCHP a redus, de asemenea, neovascularizarea indusă de ischemie, oferind dovezi suplimentare pentru funcția EPC afectată, precum și documentarea unui al doilea defect indus de dietă într-o funcție reparatorie vasculară importantă. Mai mult, putem arăta că atât capacitatea CFU-EPC a măduvei osoase, cât și neovascularizarea pot fi afectate de manipulările noastre macronutrienți la șoareci de tip sălbatic, sugerând că efectul acestor diete asupra bolilor vasculare poate avea o relevanță mai largă.

Deși este necesară prudență în extrapolarea de la astfel de studii pe animale, aceste date măresc cel puțin îngrijorarea că dietele cu conținut scăzut de carbohidrați și proteine ​​ar putea avea efecte vasculare adverse care nu se reflectă în mod adecvat în markerii de risc seric. Mai mult, aceste observații demonstrează efecte vasculare fiziopatologice importante ale macronutrienților nonlipidici care sunt disociați de creșterea în greutate. Aceste caracteristici oferă un model unic pentru înțelegerea mecanismelor aterogenezei și neovascularizării care pot avea implicații pentru eforturile de combatere a obezității și de reducere a complicațiilor acesteia.

Materiale și metode

Modele și diete de șoareci.

Șoarecii knockout ApoE au fost obținuți de la Jackson Laboratories. Puii de sex masculin au fost plasați la una dintre cele trei diete de studiu la o săptămână după înțărcare: dieta standard chow (Harlan Teklad # 2018 rozătoare chow), dieta bogată în grăsimi „occidentală” (Harlan Teklad # 88137) și o dietă cu conținut scăzut de carbohidrați la comandă fabricat conform specificațiilor noastre (Harlan Teklad). Șoarecii au fost cântăriți la intrarea în studiu și săptămânal după aceea. Aportul alimentar a fost calculat săptămânal, iar aportul mediu pe șoarece calculat pe cușcă. Pentru studii de post, șoarecii au fost postiti peste noapte (16 ore) înainte de analiză.

Analiza aortică.

Analiza serului.

Pentru analize de post, șoarecii au fost postiti peste noapte (16 ore). Sângele a fost obținut din puncția ventriculară dreaptă și stângă în momentul uciderii și a fost analizat de un analizor de chimie critică Hitachi 917 pentru colesterol total, trigliceride și glucoză. Nivelurile de insulină, NEFA, LDL oxidat, VEGF, interleukină-6 și monocite-chimioatractant-1 au fost măsurate folosind ELISA din truse, în conformitate cu indicațiile producătorilor (insulină, Crystal Chem; NEFA, substanțe chimice Wako; LDL oxidat, Mercodia; IL-6 și MCP-1, BD Biosciences; VEGF, Calbiochem). Distribuția colesterolului între clasele de mărime a lipoproteinelor a fost analizată prin cromatografie rapidă cu lichide proteice (FPLC). Pe scurt, 250 μL plasmă de șoarece reunită (n = 3) a fost filtrată (filtru 0,45-μm) și rezolvată prin cromatografie de excludere a dimensiunii utilizând o coloană Superose 6 10/300 GL (Amersham Biosciences). Conținutul de colesterol din fracțiuni (0,5 ml) a fost determinat enzimatic.

Testele unității de formare a coloniei.

Măduva osoasă întreagă a fost izolată din tibii și femururi, spălată și lizată de celule roșii din sânge. Celulele au fost numărate și 4,5 × 105 celule au fost placate pe godeu în mediu de metilceluoză semisolidă în prezența a 50 ng/ml VEGF. Coloniile au fost colorate pentru absorbția LDL acetilată dil și lecția Ulex-europeaus-FITC la 7 zile așa cum s-a descris anterior (24) și au fost numărate în mod grilat.

Analiza FACS.

Sângele integral obținut în momentul uciderii a fost lizat de celule roșii din sânge, spălat și colorat cu anticorpi la Sca-1-FITC (BD Biosciences) și Flk-1-PE (BD Biosciences). Măduva osoasă a fost recoltată de pe membrele posterioare și coloana lombară a șoarecilor, lizată de celule roșii și incubată cu anticorpi împotriva markerilor de linie (BD PharMingen) și Flk-1. Celulele au fost fixate, permeabilizate și colorate cu anticorpi împotriva Akt-Ser-473 (Cell Signaling). Anticorpii secundari au fost de la BD PharMingen. Citometria de flux a fost efectuată pe un Becton Dickinson LSR II.

Modelul de ischemie a membrelor posterioare.

Șoarecii au fost hrăniți cu diete de studiu timp de 4 săptămâni, apoi au fost anesteziați pentru ligarea arterei femurale. Arterele epigastrice și femurale profunde ale membrului posterior drept au fost cauterizate, iar suturile proximale și distale legate în artera femurală cu separarea ulterioară a arterei femurale între ligaturi. Imediat după operație, șoarecii au fost imaginați pe un Moor 785 nm aproape de infraroșu cu laser Doppler Imager-2. În zilele 2, 4, 7, 10, 15 și 28 după operație, șoarecii au fost supuși scanărilor repetate pe LDI-2. Șoarecii rămân la diete de studiu pe tot parcursul perioadei postoperatorii.

Statistici.

Testele t Student cu două cozi au fost utilizate pentru compararea a două variabile. ANOVA unidirecțională cu măsuri repetate a fost utilizată pentru analiza creșterii în greutate la șoarecii din diete. Calculele statistice au fost efectuate pe software-ul Stata 10.0. Toate datele prezentate sunt prezentate ca medii ± SD, cu excepția recuperării fluxului de la HLI, care este prezentată ca medie ± SE.

Material suplimentar

Mulțumiri.

Mulțumim Dr. Emerson Liu și Dr. Kenneth Cohen pentru sfaturi tehnice și Dr. Serafima Zaltsman pentru gestionarea expertă a coloniei de șoareci. S.Y.F. este stagiar al programului de instruire pentru investigatori clinici: Centrul Medical Beth Israel Deaconess - Harvard/Massachusetts Institute of Technology Health Sciences and Technology, în colaborare cu Pfizer Inc. și Merck și Co. Această lucrare a fost susținută de o rețea a Fundației Leducq de excelență în cercetare (R.E.G., A.R.), o Grant-in-Aid de la American Heart Association (R.E.G.) și subvenții de la National Institutes of Health (A.R., R.E.G.) A.R. recunoaște, de asemenea, cu recunoștință sprijinul din partea Judith și David Ganz și a Fundației de caritate Maxwell Hurston. A.R. este membru principal al facultății la Harvard Stem Cell Institute.

Note de subsol

Autorii nu declară niciun conflict de interese.