Laborator de neurofarmacologie moleculară, Departamentul de farmacologie și toxicologie, Institutul Național de Educație și Cercetare Farmaceutică (NIPER), Punjab, India

Laborator de neurofarmacologie moleculară, Departamentul de farmacologie și toxicologie, Institutul Național de Educație și Cercetare Farmaceutică (NIPER), Punjab, India

Laborator de neurofarmacologie moleculară, Departamentul de farmacologie și toxicologie, Institutul Național de Educație și Cercetare Farmaceutică (NIPER), Punjab, India

Laborator de neurofarmacologie moleculară, Departamentul de farmacologie și toxicologie, Institutul Național de Educație și Cercetare Farmaceutică (NIPER), Punjab, India

Abstract

Deși potențialul neuroprotector al EDR a fost investigat mai devreme, din cunoștințele noastre, nu există niciun raport care să descrie efectul neuroprotector al EDR într-un model de șobolan de leziuni focale I/R cerebrale asociate cu diabetul de tip 2 comorbid. În prezenta investigație, am testat dacă EDR ar fi, de asemenea, eficient împotriva accidentului vascular cerebral diabetic prin suprimarea stresului ER crescut/moartea celulelor apoptotice. Acest studiu are, de asemenea, semnificație, având în vedere recomandarea actualizată a mesei rotunde a industriei academice de terapie cu AVC (STAIR, 2009), care consolidează faptul că experimentele vor fi efectuate și pe modele animale cu condiții comorbide pentru o mai mare relevanță clinică și o mai bună traducere a eficacității compușilor testați din modelele preclinice la studii clinice [19].

Materiale și metode

Animale. Șobolani Sprague - Dawley masculi (120-140 g) au fost procurați de la unitatea centrală pentru animale a institutului. Șobolanii au fost hrăniți cu hrană regulată pentru pelete (Ashirwad Industries, Chandigarh) și apă potabilă ad libitum. Experimentele au fost permise în mod corespunzător de către comitetul instituțional de etică a animalelor (IAEC), NIPER și efectuate în conformitate cu liniile directoare ale comitetului în scopul controlului și supravegherii experimentelor pe animale (CPCSEA), Guvernul Indiei.

Inducerea diabetului de tip 2 la șobolani. Inducerea diabetului de tip 2 a fost efectuată la șobolani printr-o combinație de hrană cu dietă bogată în grăsimi (HFD) și doză mică de streptozotocină (STZ; Sigma, St. Louis, MO, SUA), după cum sa descris anterior [20]. Pe scurt, șobolanii au fost hrăniți cu HFD timp de 2 săptămâni și apoi au devenit diabetici printr-o singură doză mică de tratament STZ (35 mg/kg, i.p.). Probele de sânge au fost colectate inițial și la sfârșitul celor 4 săptămâni. Diferiții parametri biochimici, cum ar fi glucoza plasmatică, trigliceridele și nivelurile totale de colesterol, au fost măsurați folosind truse colorimetrice disponibile în comerț (Accurex India Pvt Ltd, Mumbai, India). Insulina plasmatică a fost determinată folosind un kit ELISA (Linco Research, St. Charles, MO, SUA). Doar șobolanii cu un nivel plasmatic de glucoză> 300 mg/dl la sfârșitul săptămânii 4 au fost considerați diabetici și incluși în studiu.

Pregătirea și tratamentul medicamentelor. EDR (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, SUA) (1, 3 și 10 mg/kg), un puternic agent de eliminare a radicalilor liberi, a fost dizolvat în soluție de NaOH 1 N și neutralizat cu HCl 1 N pentru a ajusta pH-ul la 7,4 la doză volum de 2 ml/kg. EDR a fost administrat intraperitoneal (i.p.) imediat (în decurs de 2 minute) după MCAO. Dozele de EDR au fost selectate pe baza unui raport de literatură [16]. Potențialul neuroprotector al EDR a fost evaluat atât din studiile histologice, cât și din cele neurologice funcționale, după 22 de ore de reperfuzie, după cum este descris mai jos, comparativ cu tratamentul vehiculului.

Evaluarea deficitelor neurologice funcționale. Deficitul neurologic a fost evaluat după 22 de ore de reperfuzie, după cum sa raportat mai devreme [21]. Descoperirile neurologice au fost notate pe o scară de cinci puncte. Fără deficit neurologic = 0, eșecul extinderii labei drepte complet = 1, încercuind dacă este tras de coadă = 2, încercuire spontană = 3 nu a mers spontan și a avut un nivel de conștiință deprimat = 4.

Estimarea infarctului cerebral și a volumului de edem. Șobolanii au fost uciși la 22 de ore după reperfuzie pentru estimarea infarctului cerebral și a volumului edemului. Creierele au fost tăiate în secțiuni coronare groase de 2 mm și colorate cu soluție 2% 2,3,5 - clorură de trifeniltetrazoliu (TTC), iar aria infarctului și volumul edemului au fost măsurate folosind software-ul de analiză a imaginii (Leica Qwin, Wetzlar, Germania) după cum sa raportat anterior [23]. Pe scurt, zonele de infarct ale tuturor secțiunilor creierului au fost cumulate pentru a ajunge la aria totală a infarctului care a fost înmulțită cu grosimea secțiunilor creierului pentru a ajunge la volumul de infarct. Corecția edemului volumului infarctului a fost efectuată folosind formula, corectarea volumului = (volumul infarctului × volumul contralateral)/volumul ipsilateral. Au fost calculate volumele ambelor emisfere din care s-a calculat volumul edemului prin scăderea volumului contralateral din volumul ipsilateral.

Estimarea fragmentării ADN-ului. Testarea terminală de marcare a deoxinucleotidil transferazei (TUNEL) a fost efectuată pentru a identifica gradul de fragmentare a ADN-ului în secțiunea creierului încorporat în parafină, așa cum a fost descris anterior [23]. Capătul 3 ′ al ADN-ului fragmentat a fost marcat folosind kitul de detectare a fragmentării ADN - TdT - FragEL conform instrucțiunilor producătorului (Merck, SUA). Celulele pozitive TUNEL au fost numărate din regiunea penumbrală a secțiunilor creierului și exprimate ca procent de celule pozitive TUNEL comparativ cu celulele totale.

Imunohistochimie. Analiza imunohistochimiei (IHC) pentru in situ expresia diferitelor proteine ​​de stres ER, cum ar fi GRP78 și CHOP/GADD153, a fost efectuată așa cum s-a descris anterior folosind kitul ABC pentru colorare Vecta (Vector Labs, Burlingame, CA, SUA) [24]. Marcarea specifică a fost detectată folosind diaminobenzidină ca substrat. Secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină și observate la microscopul cu lumină (Leica) peste regiunea ipsilaterală penumbrală, iar imaginile au fost achiziționate cu o cameră CCD (Leica). Deoarece GRP78 este o proteină constitutivă, imunoreactivitatea a fost măsurată pe baza modelului de notare imunohistochimică. Scorarea IHC a fost efectuată pe baza intensității colorării după cum urmează: 1 - culoare ușoară sau deloc; 2 - colorare foarte scăzută; 3 - colorare moderată; și 4 - colorare foarte intensă. Cu toate acestea, CHOP/GADD153 este o proteină inductibilă care este reprezentată cantitativ ca procent de celule pozitive CHOP/GADD153 colorate maro închis comparativ cu celulele totale.

Western blot. Western blot a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [25]. Pentru analiza Western blot, alicote care conțin cantități egale de proteine ​​au fost încărcate în fiecare godeu și supuse la 10-12% SDS - PAGE. Proteinele separate au fost transferate pe membrană de nitroceluloză și blocate cu 3% albumină serică bovină timp de 2 ore. Membranele au fost apoi testate pentru proteina GRP78 sau caspaza-12 prin incubarea cu anticorpii primari precum GRP78 (1: 500, Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, SUA) sau caspaza-12 (1: 1000; Semnalizare celulară, Davers, MA, SUA) urmată de incubație cu anticorp secundar conjugat cu fosfatază alcalină (AP) (1: 5000, Sigma, SUA) timp de 2 ore la temperatura camerei. Bloturile au fost vizualizate prin reacție enzimatică prin incubare cu un amestec de 5-brom-4-clor-3-indolil fosfat (BCIP) și nitro albastru tetrazol la temperatura camerei. Încărcarea egală a proteinelor a fost confirmată prin măsurarea β‐ actinei. Analiza densitometrică a fost efectuată utilizând software-ul de analiză NIH ImageJ. Valorile au fost normalizate cu β‐ actină.

analize statistice. Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul de analiză statistică Sigma Stat 2.0, SUA. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM, cu excepția cazului în care se prevede altfel. Toți parametrii, cu excepția scorului neurologic, au fost analizați folosind analiza unică a varianței (anova) urmată de testul de comparație multiplă al lui Tukey. Scorul neurologic este exprimat ca median și a fost analizat folosind analiza unică a varianței Kruskal - Wallis pe testul de ranguri, urmată de testul de comparație multiplă post hoc Dunn. Diferențele au fost considerate semnificative dacă p

Rezultate

Experimentul 1: Efectul HFD/STZ asupra greutății corporale și a parametrilor biochimici la șobolani.

Hrănirea injecției cu HFD și STZ la șobolani a produs caracteristici tipice ale afecțiunilor diabetice de tip 2 asociate cu o creștere semnificativă a nivelului de glucoză plasmatică, trigliceride și colesterol total. Efectele au fost observate fără reducerea semnificativă a nivelului de insulină plasmatică, precum și a greutății corporale, comparativ cu șobolanii martori normali la sfârșitul celor 4 săptămâni (tabelul 1).

Parametri Diabetic normal
Greutate corporală (g) 256,3 ± 6,1 265,2 ± 4,2
Glucoza plasmatică (mg/dl) 109,3 ± 3,2 401,3 ± 20,8 ***
Trigliceride plasmatice (mg/dl) 42,6 ± 13,2 181,4 ± 20,1 ***
Colesterol total plasmatic (mg/dl) 53,3 ± 4,3 174,3 ± 17,2 ***
Insulină plasmatică (ng/ml) 1,0 ± 0,1 0,8 ± 0,1
  • Combinația dintre dieta bogată în grăsimi (HFD) și tratamentul cu doze mici de streptozotocină (STZ) a produs trăsături caracteristice diabetului de tip 2 marcate de hiperglicemie, hipertrigliceridemie și hipercolesterolemie în prezența concentrației de insulină circulantă aproape normală (deficit relativ de insulină) la sfârșit. de 4 săptămâni de manipulare dietetică în comparație cu șobolanii martori normali. Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM. n = 5-7. ***p

Experimentul 2: Efectul EDR asupra măsurilor de rezultat histologic și funcțional.

După leziuni I/R, șobolanii diabetici au prezentat un infarct cerebral semnificativ mai mare și un volum de edem în comparație cu șobolanii diabetici care au acționat în mod fals (fig. 1). Tratamentul cu doză unică cu EDR (3 și 10 mg/kg) a produs o reducere semnificativă a volumului de infarct cerebral și edem. Cu toate acestea, o doză mică de EDR (1 mg/kg) nu a modificat semnificativ daunele neurologice (Fig. 1). În plus, monitorizarea parametrilor fiziologici vitali a arătat că tratamentul EDR nu a provocat nicio modificare semnificativă a temperaturii corpului, precum și a nivelului glicemiei în comparație cu tratamentul vehiculului (datele nu sunt prezentate).

edaravone

Efectul EDR asupra infarctului cerebral și a volumului edemului în leziunea focală I/R cerebrală asociată cu diabetul. Panoul din stânga indică secțiunile coronale ale creierului colorate TTC reprezentative ale grupurilor de șobolani I/R tratați cu diabet zaharat, vehicul și EDR (1, 3, 10 mg/kg, i.p.) tratați (A). Șobolanii diabetici I/R tratați cu vehicul au avut creșterea infarctului cerebral (panoul B) și a volumului de edem (panoul C), care au fost inhibați semnificativ prin tratamentul EDR (3 și 10 mg/kg, i.p.). Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM, n = 5-7. ***p ### p

Mai mult, pe baza evaluării funcționale, șobolanii diabetici supuși I/R au manifestat o afectare semnificativă a scorului neurologic. Tratamentul cu EDR (3 și 10 mg/kg) a îmbunătățit semnificativ recuperarea funcțională a deficitelor neurologice, după cum se reflectă în reducerea scorului neurologic (Fig. 2). Cu toate acestea, nu s-a constatat nicio îmbunătățire semnificativă cu doza mică de EDR (1 mg/kg).

Efectul EDR asupra deficitelor neurologice funcționale în leziunea focală I/R cerebrală asociată cu diabetul. A existat o afectare semnificativă a scorului neurologic la I/R diabetici tratați cu vehicul, în comparație cu șobolanii operați în mod fals. Cu toate acestea, EDR (3 și 10 mg/kg, i.p.) a îmbunătățit semnificativ recuperarea funcțională a deficitelor neurologice. Valorile sunt exprimate ca mediană, n = 5-7. *p # p

Experimentul 3: Efectul EDR asupra fragmentării ADN-ului.

Vătămarea ischemică a provocat o fragmentare extinsă a ADN-ului, dovadă fiind o creștere semnificativă a celulelor pozitive TUNEL în regiunea creierului ipsilateral penumbral a șobolanilor diabetici, în comparație cu grupul operat de fals. Tratamentul cu EDR (10 mg/kg) a atenuat semnificativ fragmentarea ADN-ului în regiunea ipsilaterală penumbrală (Fig. 3). Cu toate acestea, rareori am detectat celule TUNEL pozitive în regiunea contralaterală a creierului (datele nu sunt prezentate).

Efectul EDR asupra fragmentării ADN-ului în leziunea focală I/R cerebrală asociată cu diabetul. Panoul din stânga indică imagini reprezentative ale creierului care prezintă celule pozitive TUNEL (A, C și E) în raport cu populația totală de celule (B, D și F) colorate cu DAPI corespunzătoare ale diabetului, acționat în vehicul și EDR (10 mg/kg) grupuri I/R diabetice tratate, respectiv. Grupul de șobolani tratați cu vehiculul sa dovedit a avea mai multe celule TUNEL pozitive (indici de fragmentare a ADN-ului) în regiunea creierului ipsilateral penumbral după 22 de ore de reperfuzie în comparație cu grupul simul. EDR (10 mg/kg) a scăzut semnificativ celulele pozitive TUNEL (panoul G). Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM, n = 3-4. ***p ### p

Experimentul 4: Efectul EDR asupra imunoreactivității GRP78 și CHOP/GADD153.

Rezultatele din experimentele de imunohistochimie au arătat o creștere semnificativă a imunoreactivității proteinelor stres/apoptotice ER, și anume, GRP78 și CHOP/GADD153 în regiunea ischemică penumbrală a șobolanilor diabetici I/R comparativ cu șobolanii care funcționează fals. Cu toate acestea, tratamentul cu EDR (10 mg/kg) a dus la o reducere semnificativă a imunoreactivității GRP78 și CHOP/GADD153, reflectată de scorul IHC scăzut și, respectiv, procentul de celule pozitive CHOP/GADD153, comparativ cu tratamentul vehiculului (fig. 4).

Efectul EDR asupra imunoreactivității GRP78 și CHOP/GADD153 în leziunea focală I/R cerebrală asociată cu diabetul. Fotomicrografiile reprezentative care prezintă imunoreactivitatea GRP78 (A, B și C) și CHOP/GADD153 (D, E și F) a grupului diabetic I/R tratat cu șampon diabetic, vehicul și EDR (10 mg/kg). Șobolanii diabetici tratați cu vehicul au prezentat o creștere semnificativă a scorului IHC GRP78 (panoul G) și celulele pozitive CHOP/GADD153 (panoul H) din regiunea cerebrală peri-infarct, markeri ai stresului ER/apoptoză în comparație cu grupul de diabet zaharat. EDR (10 mg/kg) a redus semnificativ imunoreactivitatea atât a GPR78, cât și a CHOP/GADD153. Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM, n = 3-4. ***p ### p

Experimentul 5: Efectul EDR asupra exprimării GRP78 și a capsazei-12.

În concordanță cu rezultatele IHC, analiza western blot a confirmat, de asemenea, modelul similar al expresiei proteinei GRP78 în diferitele grupuri (Fig. 5). În plus, șobolanii diabetici expuși la I/R au arătat o activare semnificativă a caspazei - 12 asociată cu o reducere pronunțată a nivelului în emisferele ischemice, ipsilaterale ale creierului după 22 de ore de reperfuzie. Pe de altă parte, tratamentul EDR (10 mg/kg) a completat semnificativ nivelul caspazei - 12, posibil prin inhibarea activării acestuia în comparație cu tratamentul vehiculului (fig. 5).

Efectul EDR asupra exprimării GRP78 și caspazei-12 în leziunea focală I/R cerebrală asociată cu diabetul. Analiza Western blot a relevat, de asemenea, o creștere consistentă a expresiei GRP78 și, de asemenea, a detectat activarea semnificativă a caspazei - 12 însoțită de nivelurile reduse în urma I/R la șobolanii tratați cu vehicul, comparativ cu grupul de diabet zaharat. EDR (10 mg/kg) a scăzut semnificativ inducerea GRP78 și a redus activarea caspazei - 12. Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM. Fiecare valoare este media a trei sau patru experimente independente. ***p ### p # p

Discuţie

Concluzii

Luate împreună, aceste descoperiri experimentale demonstrează potențialul neuroprotector puternic al EDR într-un model de șobolan cu AVC diabetic. Efectul va rezulta probabil din inhibarea stresului ER și fragmentarea apoptotică a ADN-ului care implică CHOP/GADD153 și caspaza - 12. În plus, datele obținute din prezentul studiu, precum și din studiile anterioare pot deschide calea pentru viitoarele investigații clinice care vizează explorarea beneficiilor terapeutice ale EDR nu numai împotriva daunelor cerebrale I/R, ci și concomitent împotriva leziunii țesutului oxidativ induse de diabetul zaharat/complicație la subiecții diabetici AVC.

Mulțumiri

Krishnamoorthy Srinivasan recunoaște asistența financiară din partea Departamentului de Știință și Tehnologie (DST), New Delhi, Guvernul Indiei pentru această activitate de cercetare prin intermediul sistemului lor de urmărire SERC FAST (LS - 134/2008). Mulțumim și dl. Jang Bhadhur și dl. Yavinder pentru asistența lor în pregătirea HFD.

Declarație de divulgare

Autorii declară că nu există conflicte de interese.