Abstract

Funcția principală a intestinului este de a digera și absorbi substanțele nutritive din dietă, cu ajutorul epiteliului absorbant și al sistemului vasculator și limfatic subiacent, precum și al microbiomului 6. Selecția nutrienților și modificarea capacității de absorbție de-a lungul intestinului; majoritatea nutrienților din dietă sunt absorbiți în vilozitățile intestinului subțire superior (duoden (D) și jejun (J)) și într-o măsură mai mică de intestinul subțire inferior (ileon, I), în timp ce microbiota densă din I și colon C ) mediază eliberarea suplimentară de nutrienți. Intestinul găzduiește, de asemenea, cel mai mare compartiment imunitar din organism, însărcinat să ofere rezistență la toxine și să invadeze agenții patogeni, menținând în același timp toleranța la antigenele dietetice și microbiote, fie prin acțiune locală, fie prin trafic limfatic către intestin - drenând mLN-uri pentru a monta răspunsuri adaptive 1.7, 9 . Am căutat să înțelegem cum drenajul limfatic compartimentat al intestinului contribuie la un răspuns imun organizat în acest mediu complex.

compartimentat

Datele noastre descoperă un mecanism prin care sistemul imunitar intestinal tratează simultan răspunsurile de reglementare versus cele proinflamatorii: prin segregarea anatomică a acestor reacții în mLN-uri diferite, funcțional specializate. Drenajul eficient al antigenelor dietetice în toleranță - promovând ganglionii limfatici asociați cu intestinul proximal contribuie la înțelegerea prevenirii alergiilor alimentare și implică infecția duodenală și disbioza ca perturbări ale mediului care pot modifica rezultatul alergic. Este plauzibil ca vaccinarea orală să genereze în general răspunsuri imune diminuate 30 prin același mecanism. Cu toate acestea, calea duodenală tolerogenă ar putea fi exploatată terapeutic pentru inducerea toleranței la surse de antigen inflamatorii pro-inflamatorii altfel inaccesibile, cum ar fi bacteriile ileale disbiotice sau colonice în bolile inflamatorii intestinale.

Metode

Șobolani femele Wistar de 6-10 săptămâni au fost cumpărate de la Charles River. Îngrijirea și experimentarea animalelor au fost în concordanță cu orientările NIH și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Rockefeller.

Reactivi

Următorii reactivi au fost cumpărați de la Sigma: Benzil eter (108014), diclorometan (270997), Fast Green FCF (F7252), Heparin (H3393), Omeprazol (O104), Pluronic L-81 (435430), Pyrantel Pamoate (P6210), Ovalbumina (gradul VI, A2512; gradul III A5378) și Vancomicina (V2002). Ovalbumină fără LPS provenea din Hyglos, Germania (nr. Cat. 77161). 3 H –retinol și Na 125 I provin din Perkin-Elmer.

Anticorpi, colorare și citometrie în flux

Îndepărtarea țesuturilor, microscopia cu foi luminoase și reconstrucția imaginii

Pentru curățarea și colorarea țesuturilor, protocolul iDISCO a fost urmat așa cum este detaliat pe site-ul web actualizat continuu: http://idisco.info cu următoarele specificități: Țesuturile au fost colorate în anticorpi primari și secundari timp de 4 zile fiecare și au fost încorporate în 1 % agaroză-TAE înainte de deshidratarea finală. Blocurile au fost realizate cu ajutorul unui ultramicroscop LaVision II și a unui software. Imaginile au fost reconstruite folosind software-ul Imaris 8.

Biodistribuirea 3H-retinolului

Șoarecii au fost postiti timp de 3h înainte de gavaj cu 150 Pl PBS cu sau fără 5 pl de formare de chilomicron care inhibă Pluronic L-81, urmat de 1 µCi 3 H-retinol în 100 pl de ulei de măsline 30 minute mai târziu, și eșantionat la momentele indicate. Serul a fost prelevat din vena submandibulară (sistemică) sau din vena portă. Limfa a fost colectată din conducta toracică sub anestezie cu izofluran utilizând un ac de sticlă personalizat (dispozitiv de extragere a micropipetelor, instrument Sutter). Organele disecate au fost cântărite înainte de liză prin întreruperea mecanică în 0,5 ml tampon de liză hipertonică cu 1% Triton-X 100, lizatul amestecat cu 7 ml cocktail de scintilație Ultima Gold (Perkin Elmer) și acumularea de radioactivitate măsurată pe un contor de scintilație. Radioactivitatea de intrare a fost estimată prin numărarea a 10% din materialul gavat.

Segmentarea ganglionilor limfatici mezenterici

Ganglionii limfatici mezenterici care drenează segmentele intestinale au fost determinați anatomic prin urmărirea vaselor limfatice care leagă colonul, ileonul și jejunul de ganglionii lor limfatici. Ganglionii limfatici duodenali au fost dezvăluiți prin extragerea a 100 ofl de ulei de măsline (Sigma) și determinarea ganglionilor limfatici cei mai apropiați de stomac înconjurați de chyle, indicativ de drenaj duodenal, la 1h după gavaj.

Izolarea limfocitelor și APC de ganglioni limfatici

Țesuturile au fost disecate în HBSS rece, suplimentate cu Mg 2+ și Ca 2+, tocate mărunt și incubate în 400 U/ml colagenază D (Roche) în HBSS timp de 25 min la 37 ° C, 5% CO2. Colagenaza a fost stinsă pe gheață prin adăugarea de FCS final de 10%. Suspensiile cu o singură celulă au fost extrase din țesutul conjunctiv prin preluarea și resuspendarea digestelor de cinci ori. Eritrocitele au fost lizate prin incubare în tampon de liză eritrocitară (Sigma) timp de 7 minute la RT.

Izolarea limfocitelor și a APC din intestinul subțire și gros

Izolarea celulelor pentru ARN-seq

Celulele au fost sortate folosind un citometru de flux de sortare a celulelor FACS Aria (Becton Dickinson). Celulele dendritice MLN au fost pre-îmbogățite folosind un kit de izolare a celulelor pan dendritice (130-100-875, Miltenyi Biotec) și coloane de separare LS MACS (Miltenyi Biotec). Bărbații C57BL/6 în vârstă de 14 săptămâni au servit ca donatori mLN și s-au colectat triplicate biologice sau cvadruplicate. Celulele dendritice au fost sortate ca Aqua - CD45 + Lin - (CD3 - B220 - NK1.1 - CD19 -) CD11c hi, iar subpopulațiile în continuare ca MHCII hi CD103 + CD11b - și MHCII hi CD103 + CD11b +. Trei sute de celule au fost sortate direct în 25 μl tampon TCL (Qiagen, 1031576) suplimentat cu 1% β-mercaptoetanol la o singură celulă de precizie. Probele au fost ținute la temperatura camerei timp de 5 minute, rotite și ținute la -80 °C până la prelucrarea ulterioară.

Pregătirea și secvențierea bibliotecii ARN-seq

Analiza datelor ARN-seq

A fost verificată contribuția egală a probelor la citiri. Citirile brute au fost aliniate folosind Kallisto și expresia diferențială a fost efectuată cu DESeq2. O valoare p de 0,05 a fost utilizată ca limită pentru a determina gene exprimate diferențial evidențiate în comploturile vulcanice. Graficele PCA și graficele vulcanului au fost generate în R. Un fișier clasat a fost generat pe baza modificărilor log2 ori și ulterior a rulat ca o analiză GSEA Preranked (GSEA v3.0) cu c5.all.v6.1.symbols.gmt (Gene Ontology ) baza de date a setului de gene. Toate căile cu o rată de detectare falsă (FDR) de 0,25 sau mai puțin au fost considerate semnificativ diferite între probe.

Testul activității RALDH

Activitatea RALDH a fost determinată folosind kitul Aldefluor (STEMCELL TM Technologies) conform protocolului producătorului.

125 I-OVA etichetare și biodistribuire

Iodarea OVA a fost efectuată așa cum sa descris anterior 14. Șoarecii au fost postiti timp de 3 h înainte de gavaj cu 4 x 106 CPM 125 I-OVA și 50 mg OVA rece (gradul III) în 200 pl PBS și probele au fost prelevate la 1 h și 5 h după gavaj. Greutatea umedă a țesuturilor a fost luată înainte de măsurarea radioactivității pe un contor gamma (Packard Cobra). Radioactivitatea de intrare a fost estimată prin numărarea a 10% din materialul gavat.

Transfer de celule T adoptive

Celulele T CD4 naive din splină și ganglioni limfatici au fost izolate prin selecție negativă utilizând anticorpi biotinilați împotriva CD8α, CD25, CD11c, CD11b, TER-119, NK1.1 și B220 și perle MACS anti-biotină (Miltenyi Biotec). Puritatea celulelor T CD4 + transgenice a fost verificată prin citometrie în flux (CD45.1 + Vα2 + Vβ5 + CD25 - pentru celulele OT-II, CD45.1 CD45.1 + Vβ14 + CD25 - pentru celulele 7B8tg, de obicei> 90%). Celulele T au fost marcate folosind Trusa de Proliferare a Celulelor Cell Trace ™ Violet sau CFSE (Life Technologies). Pentru celulele OT-II, 2 × 106 au fost transferate prin injecție retro-orbitală sub anestezie cu izofluran gazos. Pentru celulele 7B8tg, 4 x 105 celule au fost transferate pentru analiza mLN la 60 h post-transfer și 5000 de celule pentru analiză la 7 zile sau mai mult după transfer în intestin și mLN.

Administrare de antigen oral

OVA (gradul III, Sigma, A5378) a fost administrat la 50 mg în 200 Pl PBS prin gavaj oral folosind ace de gavaj metalice. Au fost administrate două doze cu un interval de 24 de ore. Peptida SFB FSGAVPNKTD (personalizată cu acetilare N-terminală, LifeTein, LLC.) A fost administrată fie ca 1 mg sau 5 mg în 200 Pl PBS prin gavaj oral după i.p. tratament cu 1 mg inhibitor al pompei de protoni Omeprazol (în 200 µl PBS, 1% Tween 80) administrat cu 24 ore și 15 minute înainte de gavaj pentru a reduce digestia peptidei în stomac. Șoarecilor martor li s-a administrat numai Omeprazol.

S. venezuelensis trecere și infecție

S.venezuelensis a fost menținut la șobolanii Wistar prin infecție subcutanată cu 30.000 de larve. Ziua 6-8 p.i. ouăle care conțin cecum au fost recoltate și răspândite pe hârtie Whatman care a fost plasată într-un pahar cu apă la 28 ° C. Larvele de eclozare au fost colectate pe parcursul a 4 zile și ciclul a fost reluat. Șoarecii au fost infectați subcutanat cu 700 de larve/șoareci. Sarcina de viermi adulți a fost evaluată în totalul zgârieturilor epiteliale ale intestinului.

Imunizarea alumului și provocarea căilor respiratorii

La șapte zile după administrarea orală a OVA, s-a injectat 4 µg de antigen OVA fără endotoxine adsorbit la 40 Iml Imject ™ Alum Adjuvant (Fisher Scientific) i.p. într-un volum final de 400 madel alcătuit cu PBS. Imunizarea s-a repetat după 7 zile. Pentru a induce inflamația căilor respiratorii, șoarecii au fost anesteziați și li s-au administrat intranazal 10 µg de OVA steril grad VI în 50 µl PBS (25 perl per nară) în zilele 14, 17 și 21 după primul i.p. imunizare. IgE total a fost măsurat pentru a confirma infecția anterioară cu S. venezuelensis (250-350 ng/ml în plasmă comparativ cu 5-10 ng în plasmă la șoareci neinfectați) 14 .

Spălarea bronhoalveolară (BAL), histologia pulmonară și analiza infiltratului prin citometrie în flux

Șoarecii au fost anesteziați prin i.p. injectarea a 0,35 ml de 2,5% avertină (Sigma), traheea a fost canulată și plămânii au fost spălate o dată cu 0,5 ml și apoi 1,0 ml PBS. Celulele BAL totale au fost numărate după liza eritrocitară și colorate pentru analiza FACS. Plămânii au fost perfuzați prin ventriculul drept cu 10 ml de soluție salină pentru a spăla sângele rezidual. Un lob a fost digerat în 400 U/ml colagenază D/HBSS și procesat pentru analiza FACS. Eozinofilele au fost determinate ca CD45 + SSA hi MHCII - CD11b + Ly6G int SiglecF +, neutrofile ca CD45 + SSA hi MHCII - CD11b + Ly6G hi SiglecF - și DC ca CD45 + MHCII + CD11c + CD64 - SiglecF - .

IgG1 anti-OVA și ELISA IgE totale

ELISAS au fost efectuate așa cum sa descris anterior 14 .

Colonizarea și epuizarea SFB

SFB a fost obținut din stocuri înghețate de conținut de cecal (menținut la -80 ° C timp de mai puțin de 6 luni) de șoareci monocolonizați cu SFB, care au fost diluați în PBS (2 ml/cecum) și trecuți printr-o plasă de 70 μm. Șoarecii au fost colonizați de două gavaje de 0,4 ml de preparat de conținut cecal, la distanță de 24 de ore. Pentru SFB epuizant, șoarecii au fost tratați cu 200 ofl de 10 mg/ml Vancomicină cu 10, 9 și 8 zile înainte de transferul adoptiv al celulelor 7B8, iar cuștile au fost schimbate de fiecare dată pentru a minimiza recolonizarea prin SFB rămase în fecale. Colonizarea sau epuizarea a fost verificată prin PCR în timp real a ADN-ului fecal (trusă de miniprep microb fecal-sol-Quick-DNA, cercetare Zymo, nr. Cat. D6010). PCR a fost efectuat în prezența mixului master PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems, 4367659) pe o mașină PCR Quant Studio 3 (Applied Biosystems), folosind grunduri SFS specifice 16S (fwd: GACGCTGAGGCATGAGAGCAT, rev: GACGGCACGGATTGTTATATCA a fost CF normal) Ct obținut în PCR folosind primerii bacterieni universali 16S (fwd: ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT, rev: ATTACCGCGGCTGCTGGC).

Chirurgia ganglionilor limfatici

Urmărire verde rapidă

Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran și cavitatea lor peritoneală a fost expusă. 3-5 ofl de 10% Fast Green în PBS au fost injectate în muscularisul ileonului terminal folosind un dispozitiv de nano-injecție (Nanoject III, Drummond). S-a urmărit răspândirea culorii verzi prin limfatic până când s-a acumulat în ganglionul limfatic de drenare a ileonului și până când s-a estompat din nou (șoareci acționați în mod fals) și a ajuns la lumenul duodenal prin conducta biliară, nu mai mult de 15 minute. Aceeași sincronizare a fost aplicată la șoareci la care au fost îndepărtați mLN ileal și cecal, chiar dacă colorantul nu s-a acumulat niciodată într-un ganglion limfatic.

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată în software-ul GraphPad Prism 7.0. Datele multivariate au fost analizate prin aplicarea ANOVA unidirecțională și a testului post hoc de comparație multiplă a lui Tukey, comparație între două condiții de tratament prin testul t Student cu o singură coadă nepereche. O valoare P mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă.

Contribuțiile autorului

D.E. a inițiat, proiectat, efectuat și analizat cercetarea și a scris lucrarea. M.C.C.C. proiectat și efectuat studii de infecție și chirurgie. L.M. a efectuat sortarea DC și a ghidat pregătirea bibliotecii ARN-seq, P.A.M. a efectuat alinierea și analiza datelor ARN-seq și injecție verde rapidă. A.L. a efectuat studii radioactive. A.M.C.F a inițiat modelul S. venezuelensis și a contribuit la proiectarea experimentală folosind modelul. Toți autorii au editat lucrarea. D.M. a inițiat, proiectat și supravegheat cercetarea și a scris lucrarea.

Interese concurente

Autorii declară că nu există interese financiare concurente.

Materiale și corespondență

Daria Esterházy (desterhazyrockefeller.edu) sau Daniel Mucida (mucidarockefeller.edu)

Legendele figurii extinse

Figura 1. Caracterizare extinsă a organizării limfaticelor sistemului imunitar intestinal și a absorbției dietetice a retinolului.