Abstract

Inițierea sintezei proteinelor eucariote necesită numeroși factori pentru legarea și poziționarea corectă a ARNm pe ribozomul 40S. Înainte de interacțiunea ribozomului 40S și ARNm, grupul factorilor de inițiere eucariotici 4 (eIF4), eIF4A, eIF4B și eIF4F, funcționează în derularea structurii secundare dependente de ATP în regiunea 5 'netradusă (UTR) a ARNm (pentru recenzie, a se vedea Dever, 2002; Mathews, 2002; Sonenberg și Dever, 2003; Pestova și colab., 2007; Gallie, 2007). eIF4A, o singură polipeptidă (aproximativ 50 kD), este prototipul DEAD/H helicază și are motive de legare ATP și helicază (pentru o revizuire, vezi Rogers și colab., 2002). eIF4B este o proteină de legare a ARN (aproximativ 59 kD) care funcționează pentru a spori activitatea helicazei eIF4A și eIF4F (Bi și colab., 2000; Rogers și colab., 2001). Complexul de legare a capacului, eIF4F, este compus din două subunități, eIF4E (aproximativ 24 kD) și eIF4G (aproximativ 200 kD). eIF4E este proteina care leagă capacul, iar eIF4G interacționează cu mai multe componente ale mașinilor de translație, inclusiv eIF3, eIF4A și proteina de legare poli (A) (PABP; pentru revizuire, consultați Prévôt și colab., 2003). Plantele au a doua formă de eIF4F, eIF (iso) 4F, care are activități similare cu eIF4F, dar este compusă din subunitățile distincte genetic eIF (iso) 4G (aproximativ 86 kD) și eIF (iso) 4E (aproximativ 24 kD; Browning, 1996).

eIF4B a fost izolat din reticulocite de iepure (Trachsel și colab., 1977; Benne și Hershey, 1978), drojdie (Saccharomyces cerevisiae; Altmann și colab., 1993; Coppolecchia și colab., 1993), Drosophila melanogaster (Hernandez și colab., 2004) și plante (Browning și colab., 1989; Metz și colab., 1999). Stimulează traducerea ARNm, hidroliza ATP și activitățile de derulare a eIF4F și eIF4A (Grifo și colab., 1983, 1984; Ray și colab., 1985; Abramson și colab., 1987, 1988a, 1988b; Browning și colab., 1989; Rozen și colab., 1990; Lorsch și Herschlag, 1998; Bi și colab., 2000; Rogers, și colab., 2001; Khan și Goss, 2005). eIF4B are, de asemenea, un rol în traducerea mediată de site-ul ribozomului picornaviral (Meyer și colab., 1995; Ochs și colab., 1999, 2002; Rust și colab., 1999), oprirea traducerii mARN-ului gazdă herpes simplex (Doepker și colab., 2004) și reinitierea ARN policistronic a virusului mozaicului conopidă (Park și colab., 2004). eIF4B este o țintă pentru degradare în timpul apoptozei (Bushell și colab., 2000). Astfel de rapoarte sugerează un rol important pentru eIF4B în inițierea traducerii. Cu toate acestea, întreruperea genei unice pentru drojdia eIF4B nu este letală. Rezultă un fenotip care este sensibil la frig și care crește încet (Altmann și colab., 1993; Coppolecchia și colab., 1993). În mod similar, mutarea interferenței ARN a genei unice Drosophila eIF4B sugerează că eIF4B este necesară în timpul foametei, dar nu este esențială pentru supraviețuire în condiții optime (Hernandez și colab., 2004). Spre deosebire de alți factori de inițiere, eIF4B este slab conservat la plante, animale și ciuperci la nivelul secvenței de aminoacizi. Astfel, eIF4B este cel mai probabil conservat la nivelul structurii și/sau funcției.

Regiunea responsabilă de dimerizarea in vitro a nivelului scăzut de legare a eIF4B și ARN de grâu este situată în capătul C al proteinei și conectează cele două sitemuri de interacțiune tandem eIF4A și PABP (Cheng și colab., 2008). Dimerizarea parțială a grâului eIF4B in vitro este stimulată în prezența zincului (Cheng și colab., 2008).

Atât mamiferele, cât și grâul eIF4B sunt puternic fosforilate (Duncan și Hershey, 1985, 1989; Manzella și colab., 1991; Gallie și colab., 1997; Le și colab., 1998, 2000), sugerând un rol în reglarea sintezei proteinelor . S6 kinaza și alți membri ai familiei AGC kinază fosforilează Ser-405 și/sau Ser-422, două situri receptive la ser în eIF4B la mamifere (Raught și colab., 2004; Shahbazian și colab., 2006; van Gorp și colab., 2009). În prezent, nu se știe dacă există site-uri comparabile în planta eIF4B. La plante, eIF4B interacționează cu PABP (Le și colab., 1997, 2000; Bi și Goss, 2000; Luo și Goss, 2001; Khan și Goss, 2005; Cheng și Gallie, 2007), iar această interacțiune este stimulată de prezența de zinc. Zincul conferă, de asemenea, specificitatea legării PABP la eIF4B peste eIF (iso) 4G (Cheng și colab., 2008). Starea de fosforilare a eIF4B și PABP sunt importante pentru interacțiunea lor (Le și colab., 2000). Planta eIF4B prezintă o legare mai mare pentru polipurine, deși va lega polipirimidinele (Gallie și Tanguay, 1994; Cheng și Gallie, 2006). Interacțiunea eIF4B și PABP crește activitatea ATPază și ARN helicază a complexului eIF4A/eIF4B/eIF (iso) 4F. Acest lucru sugerează că PABP ar putea stimula scanarea ARNm de către complexul eIF4 și, prin urmare, va crește rata de inițiere a traducerii (Bi și Goss, 2000). Afinitatea de legare a capacului eIF (iso) 4F și afinitatea de legare poli (A) a PABP sunt, de asemenea, îmbunătățite de aceste interacțiuni (Le și colab., 1997; Wei și colab., 1998; Khan și Goss, 2005). Astfel, interacțiunile dintre PABP, eIF4B și eIF (iso) 4F ar putea oferi niște ARNm plafonați și poliadenilați cu un avantaj tradițional competitiv (Bi și Goss, 2000; Khan și Goss, 2005).

variației

SDS-PAGE și analiza occidentală a preparatelor eIF4B utilizate în testele de traducere in vitro. A, Fiecare bandă conține aproximativ 2 μg de proteine. Banda 1, grâu nativ eIF4B; banda 2, grâu recombinant eIF4B; banda 3, Arabidopsis recombinant eIF4B2; banda 4, Arabidopsis recombinant eIF4B1. Markerii greutății moleculare sunt conform indicațiilor. Gelul a fost colorat cu Coomassie Blue Brilliant. B, Pata de fluorură de poliviniliden a fost incubată cu o diluție de 1/1000 de anticorpi de iepure Arabidopsis eIF4B2 purificați prin afinitate peste noapte la 4 ° C. O diluție de 1/25.000 de anticorpi de capră anti-iepure de hrean peroxidază (Kirkegaard și Perry Laboratories) a fost incubată timp de 2 ore la temperatura camerei (Browning și colab., 1990). Benzile reactive pentru anticorpi au fost vizualizate prin chemiluminiscență (SuperSignal; Pierce) și expuse la film. Banda 1, grâu nativ eIF4B (0,9 μg); banda 2, grâu recombinant eIF4B (0,3 μg); banda 3, Arabidopsis nativ eIF4B (5 μg); banda 4, Arabidopsis recombinant eIF4B2 (0,3 μg); banda 5, Arabidopsis recombinant eIF4B1 (0,3 μg).

Anticorpi împotriva Arabidopsis eIF4B

Anticorpii împotriva Arabidopsis eIF4B2 au fost crescuți la un iepure. Antiserele au reacționat încrucișat cu AteIF4B nativ, AteIF4B1 recombinant și cu eIF4B atât de grâu nativ, cât și recombinant (Fig. 2B). Antiserurile eIF4B2 au reacționat încrucișat cu fragmentul de degradare C-terminal al AteIF4B1 (datele nu sunt prezentate).

Analiza filtrării gelului de grâu și Arabidopsis eIF4B

Studiile anterioare care utilizează filtrarea pe gel au indicat faptul că mamiferele (Methot și colab., 1996b) și grâul eIF4B (Metz și colab., 1999) pot exista ca homodimeri. Pentru a determina doamna nativă în sare scăzută (0,1 m KCl) și mare (0,5 m KCl), filtrarea gelului FPLC a fost efectuată folosind o coloană Sephacryl S-200HR (interval de separare 5.000-250.000 greutate moleculară) pentru grâu nativ și recombinant eIF4B precum și izoformele Arabidopsis eIF4B. Nu am găsit nicio dovadă că volumul de eluție diferă între condițiile de sare scăzută și mare pentru oricare dintre izoformele eIF4B (Tabelul I). În plus, toate izoformele s-au eluat la 1,0-1,5 mL una de cealaltă, ceea ce sugerează că au avut doamna similară. Diferențele dintre masele moleculare native aparente (aproximativ 100-120 kD) și masa moleculară adevărată (aproximativ 59 kD) au sugerat că eIF4B formează dimeri așa cum sa raportat anterior (Metz și colab., 1999) sau nu are o formă globulară și în mod aberant în mediul de filtrare a gelului.

Tabelul I.

FPLC Sephacryl S-200 gel filtrare analiză a grâului și Arabidopsis eIF4B izoforme