Roluri Conceptualizare, Investigație, Metodologie, Vizualizare, Scriere - schiță originală

profilurile

Afiliere Institutul de parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia

Roluri Curarea datelor, validare

Afiliere Institutul de parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia

Roluri Arhivarea datelor, Investigații

Afiliere Institutul de parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia

Roluri Administrare proiect, supraveghere

Afilieri Institutul de Parazitologie Witold Stefański Academia Poloneză de Științe, Twarda, Polonia, BIOMIBO, Varșovia, Polonia

  • Michalina Kazek,
  • Agata Kaczmarek,
  • Anna Katarzyna Wrońska,
  • Mieczysława Irena Boguś

Cifre

Abstract

Citare: Kazek M, Kaczmarek A, Wrońska AK, Boguś MI (2019) Dieta influențează profilurile bacteriene și de acizi grași liberi ai cuticulei larvelor Galleria mellonella. PLoS ONE 14 (2): e0211697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211697

Editor: Fabio S. Nascimento, Universitatea din Sao Paulo Facultatea de Filosofie a Științelor și Literelor din Ribeirao Preto, BRAZILIA

Primit: 4 iulie 2018; Admis: 19 ianuarie 2019; Publicat: 7 februarie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele care stau la baza studiului se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost parțial susținută de grantul Centrului Național pentru Cercetare și Dezvoltare POIG.01.04.00-14-019/12 către MIB și de către Oficiul Marshal’s of Mazowieckie Voivodeship grant RPMA.01.02.00-14-5626/16. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Insectele cuprind cea mai numeroasă și răspândită clasă de animale. Importanța lor pentru viața de pe pământ este imensă: joacă un rol important în circulația și distribuția materiei organice, participă la reproducerea plantelor prin polenizare și fac parte din dieta multor animale vertebrate. Cu toate acestea, în ciuda beneficiilor oferite de unele specii, multe altele sunt considerate dăunători sau vectori ai diferitelor boli [1-3].

Molia ceara cea mai mare, Galleria mellonella (ordinul Lepidoptera) este un membru al subfamiliei Galleriinae din familia Pyralidae [13]. Este un dăunător omniprezent al a două specii de albine: Apis mellifera și Apis cerana, în special în regiunile tropicale și subtropicale. Molia pătrunde mai întâi în stupii lor, după care larvele sale sapă în celulele care conțin polen, puietul de albine și miere, rezultând daune grave stupului și populației de albine; de fapt, se crede că molia ceara mai mare este unul dintre factorii care contribuie la declinul populațiilor de albine domestice și sălbatice.

Cu toate acestea, larvele de G. mellonella au fost folosite recent ca alternativă la vertebrate ca gazde model pentru studierea microorganismelor patogene [14-16]. Larvele oferă multe avantaje ca model de gazdă. Cel mai important, acestea pot fi menținute la 37 ° C, permițând astfel studierea microorganismelor în condițiile de temperatură la care sunt patogene pentru gazdele umane. În plus, acestea permit utilizarea mai multor opțiuni pentru administrarea facilă a agentului patogen: injecție, administrare orală sau aplicare topică. Larvele de G. mellonella sunt, de asemenea, ieftine și ușor de întreținut. În plus, această specie este cunoscută ca fiind susceptibilă la 29 de specii de ciuperci, șapte viruși, o specie de parazit și 16 toxine biologice [16].

Scopul principal al acestui studiu a fost de a determina dacă susceptibilitatea la infecții fungice demonstrată de două populații de larve de ceai mai mare (G. mellonella), adică una menținută pe o dietă naturală și cealaltă hrănită cu o dietă semi-artificială, este corelată cu profilurile lor cutanate de FFA, astfel cum se determină prin tehnica GC/MS. Studiul examinează, de asemenea, microflora bacteriană pe cuticula ambelor populații de G. mellonella. Un element important semnificativ al cercetării noastre este că aceasta este prima examinare a influenței dietei asupra rezistenței G. mellonella la ciuperci entomopatogene. Acest studiu nu numai că oferă informații importante în domeniul fiziologiei insectelor și al imunologiei insectelor, ci reprezintă, de asemenea, o referință utilă pentru studiile viitoare.

Materiale și metode

Ciuperca Conidiobolus coronatus

C. coronatus (Entomopthorales), izolat numărul 3491, inițial izolat din Dendrolaelaps spp., A fost primit din colecția Prof. Bałazy (Academia Poloneză de Științe, Centrul de Cercetare pentru Mediul Agricol și Forestier, Poznań).

Coloniile fungice au fost cultivate în mod obișnuit în cutii Petri de 90 mm pe mediu de agar Sabouraud. Au fost incubați la 20 ° C sub o fotoperioadă de 12 ore (L: D 12:12) pentru a stimula sporularea [17]. Larvele omogenizate de G. mellonella au fost adăugate la mediu la o concentrație finală de 10% în greutate umedă (SAB-GM) pentru a crește virulența. Coloniile fungice utilizate pentru experimente au fost cultivate timp de șapte zile.

Insecte

Două culturi de molii de ceară, G. mellonella (Pyralidae, Lepidoptera), au fost crescute în camere de sticlă la 30 ° C, 70% umiditate relativă și în întuneric constant. Un grup a fost menținut pe o dietă semi-artificială compusă din făină de grâu, tărâțe de grâu, lapte uscat, făină de porumb, drojdie uscată, glicerină, miere și apă, așa cum este descris de Sehnal [18] Insectele din al doilea grup au fost crescute sub aceleași condiții optime de creștere, dar au fost hrănite cu ceară naturală de albine luată din stupi naturali. În fiecare grup, cel puțin cinci generații au fost crescute în aceste condiții. După ce au ajuns la ultimul (al șaptelea) stadiu, după ce au încetat să se hrănească înainte de a intra în metamorfoză (larvele de ultimul stadiu de 5 zile, 5DL7), larvele au fost cântărite și utilizate în experimente.

Larvele 5DL7 hrănite în mod natural și semi-artificial au fost expuse timp de 24 de ore la colonii C. coronatus complet crescute și sporulante. Aproximativ 15 indivizi au fost menținuți în fiecare cutie Petri și s-a format un grup de control din larve expuse timp de 24 de ore la SAB-GM steril. Aceasta s-a dovedit a fi cea mai eficientă metodă de infecție, fiind una care seamănă cel mai mult cu procesul natural de infecție [19]. După expunere, insectele au fost transferate în vase Petri noi, curate, cu alimente adecvate și dezvoltarea lor ulterioară a fost inspectată zilnic. Insectele destinate extracțiilor lipidice cuticulare au fost înghețate și menținute la -80 ° C până la analiză.

Identificarea bacteriilor

Pentru a identifica bacteriile prezente pe cuticula G. mellonella, cinci larve și 100 ml de soluție salină tamponată cu fosfat steril (PBS) au fost colectate într-un balon steril de 250 ml și agitate timp de 10 minute. După acest timp, 500 μl din suspensie au fost luate și cultivate pe cutii Petri cu Agar Columbia suplimentat cu 5% sânge de oaie. Coloniile au fost incubate timp de 24 de ore la 30 ° C (condiții optime de creștere pentru larvele G. mellonella). Pentru fiecare cultură, au fost efectuate cinci repetări independente. În etapa următoare, coloniile bacteriene unice au fost izolate și cultivate pe noi cutii Petri cu Agar Columbia cu 5% sânge de oaie. Din nou, vasele au fost incubate timp de 24 de ore la 30 ° C. Pentru selecție preliminară, s-a efectuat colorarea Gram. Examinarea microscopului a fost efectuată folosind un microscop Axio Vert A1 (Zeiss) și achiziția de imagini cu software-ul Zen (Zeiss).

Bacteriile prezente pe cuticula insectelor au fost identificate folosind un sistem Vitek 2 Compact (Biomerieux). Cardurile VITEK GP pentru bacteriile Gram-pozitive și cardurile VITEK BCL pentru tulpinile Bacillus au fost utilizate după identificarea microscopică. În teste, s-au utilizat 0,5-0,6 suspensii bacteriene McFarland pentru cardul GP și 1,8-2,2 suspensii McFarland pentru cardul BCL.

Valorile Concentrației minime inhibitorii (MIC) ale gentamicinei, vancomicinei, cloramfenicolului și tetraciclinei împotriva bacteriilor izolate au fost determinate folosind testul E (Biomerieux). Suspensiile bacteriene (densitatea 0,5 McFarland) au fost cultivate la suprafață pe cutii Petri cu mediu Mueller Hinton Agar (Biocorp). După aceasta, bare de testare E au fost puse pe vase, iar valorile MIC au fost citite după o perioadă de incubație de 24 de ore la 37 ° C. Pentru fiecare izolat, s-au efectuat trei replicări independente.

Extracția acizilor grași fără cuticule (FFA)

Pentru a izola componentele lipidice de suprafață pentru analiza GC/MS, larvele au fost extrase timp de cinci minute în 20 ml de diclormetan (Sigma). Extractele au fost apoi plasate în baloane de sticlă și evaporate sub azot. Tabelul 1 include numărul de insecte utilizate, precum și masele extractelor.

Metoda de derivatizare

Esterii de trimetilsilil (TMS) ai FFA au fost obținuți prin adăugarea a 100 μl de amestec BSTFA: TMCS 99: 1 (Sigma) la 1 mg din fiecare extract și încălzirea timp de o oră la 100 ° C. TMS-urile acizilor grași au fost apoi analizate prin GC/MS.

Analize GC/MS

Analizele au fost efectuate cu un sistem GCMS-QP2010 cu detector de masă (Shimadzu) și baza de date a spectrelor de masă NIST 11. Heliul a fost folosit ca gaz purtător. Modul de injecție a fost împărțit. A fost utilizată o coloană ZB-5MSi (Zebron) (grosime 0,25 μm, lungime 60m, diametru 0,25 μm) Ciclul de temperatură al cuptorului coloanei a fost menținut la 80 o C timp de trei minute și apoi a fost accelerat de la 80 o C la 310 o C la 4 o C/minut; temperatura finală a fost apoi menținută timp de 10 minute. Temperatura sursei de ioni a fost de 200 o C. Temperatura interfeței a fost de 310 o C.

Toți compușii au fost identificați pe baza modelelor de fragmentare și pe baza ionilor derivați de silil și a bibliotecii NIST 11. Spectrul de masă al esterilor trimetilsililici ai acizilor grași a relevat prezența următoarelor ioni: M + (ion molecular), [M-15] + și ioni fragmentați la m/z 117, 129, 132 și 145. 19-metilarachidic acidul (Sigma-Aldrich) (1 mg/ml) a fost utilizat ca standard intern (IS). Conținutul a fost calculat din zonele de vârf relative care au fost comparate cu aria de vârf a IS și exprimate ca procent (%, greutate/greutate) din extracte totale. Factorii de răspuns ai unuia au fost presupuși pentru toți constituenții.

Statistici

Rezultatele obținute au fost testate folosind testul t al Studentului neparametric și ANOVA unidirecțional, rezultatele fiind semnificative la p≤0,05. Software-ul STATISTICA (StatSoft Polska) a fost utilizat pentru evaluarea datelor. Valorile p obținute sunt prezentate în secțiunea Rezultate.

Rezultate

Variațiile sensibilității larvelor G. mellonella crescute pe dieta naturală și semi-artificială la infecția fungică

Expunerea larvelor G. mellonella cultivate pe o dietă semi-artificială la coloniile sporulante de C. coronatus a dus la apariția unor pete negre pe cuticulele tuturor insectelor (N = 80) la terminarea expunerii (Fig. 1). Mortalitatea larvelor după contactul cu agentul fungic fungic a fost de 32,5% după 24 de ore și de 100% după 48 de ore. În schimb, larvele crescute pe o dietă naturală (N = 80) au fost mai rezistente la ciupercă: Nu s-au observat modificări morfologice majore la nivelul cuticulelor la 24 de ore după terminarea tratamentului, cu excepția câtorva pete negre (Fig. 1). Mai multe pete negre au apărut 24 de ore mai târziu, dar într-o măsură mai mică decât cele observate la larvele hrănite cu o dietă semi-artificială, iar mortalitatea a atins doar 45%. Fotografiile cu insecte după infecție fungică, crescute pe diete semi-artificiale sau naturale, sunt prezentate în Fig 1.

Efectele infecției fungice asupra larvelor G. mellonella menținute în dietele semi-artificiale (A) și naturale (B). Petele negre de pe corpurile larvele indică modificări care apar în timpul infecției fungice.

A fost examinată și influența dietei asupra dezvoltării și greutății insectelor. Au fost utilizate 35 de larve 5DL7 crescute pe o dietă Sehnal și 23 de larve 5DL7 crescute pe ceară de albine. Săgețile indică mici pete negre (locul invaziei fungice), care erau rareori prezente pe suprafața cuticulei când larvele erau hrănite numai cu ceară naturală. Nu s-au găsit diferențe semnificative în greutatea corporală între cele două grupuri (193,2 ± 6,5 mg pentru larvele hrănite cu ceară de albine N = 23; 189,1 ± 4,5 mg N = 35 pentru larvele semi-artificiale alimentate cu diete; p = 0,5980; F ( 22,34) = 1.329; vezi și setul de date S1)

Diverse microflore bacteriene pe cuticula ambelor populații de G. mellonella.

Flora bacteriană diferită a fost observată pe suprafețele cuticulelor celor două grupuri de larve de G. mellonella (Tabelul 1, Fig. 2 și Tabelul S1). Cinci specii de bacterii au fost găsite pe larvele crescute în dieta Sehnal: Bacillus sublitis, Bacillus cereus, Kocuria kristinae, Enterococcus caseliflavus și Enterococcus faecalis. Cu toate acestea, doar trei specii au fost identificate pe cuticula larvelor hrănite cu ceară de albine: B. subtilis, Brevibacillus laterosporus și E. casseliflavus. În timp ce B. subtilis și E.casseliflavus au fost prezenți pe cuticulele ambelor grupuri de larve, extensia a fost mai mare în larvele alimentate semi-artificiale. Cea mai mare extensie a fost observată în cazul B. laterosporus (68%).

Bacteriile identificate în culturile microbiene de pe suprafața cuticulei larvelor G. mellonella menținute pe o dietă semi-artificială (A) și naturală (B). Colorarea Gram a fost utilizată pentru a identifica speciile de bacterii.

Analiza GC/MS a compoziției de acizi grași a cuticulei G. mellonella

Rezultatele extracției lipidice cuticulare au variat în funcție de dieta G. mellonella (Tabelul 2; vezi și setul de date S2). Analiza a inclus 20 de larve crescute pe dieta Sehnal și 30 de larve crescute pe ceară de albine. Exemple de spectre de masă ale esterilor trimetilsilil (TMS) ai acidului hexadecanoic (C 16: 0) și ai acidului hexadecenoic (C 16: 1) sunt date în Fig 3, iar curentul ionic total (TIC) al esterilor trimetilsililici (TMS) )) de FFA (după derivatizare) extrase de diclormetan din ambele grupuri de larve de G. mellonella sunt prezentate în Fig 4.

Spectrul de masă al esterului trimetilsilil (TMS) al acidului hexadecenoic (A) și al acidului hexadecanoic (B).

Analizele calitative și cantitative GC-MS au constatat că FFA-urile identificate conțineau între patru și 26 de atomi de carbon în lanțul alchil. Cele două grupuri de larve au demonstrat profiluri diferite de FFA. FFA cu lanț scurt, cum ar fi C4: 0, C5: 0, C6: 0, C7: 0 și C8: 0, au fost observate numai în larvele crescute pe o dietă Sehnal semi-artificială, în timp ce mai multe FFA cu lanț lung variind de la C21: 1 până la C26 au fost găsite în larvele hrănite cu ceară de albine. Tabelul 3 listează toți acizii grași identificați în extracte obținute de la insecte, calculate ca μg/g corp de insectă (vezi și setul de date S3).

Toate rezultatele au fost calculate ca μg/g corp de insectă.

Cincisprezece acizi grași au fost găsiți pe larvele G. mellonella crescute în dieta semi-artificială și șaisprezece în cele crescute în dieta naturală. Opt acizi grași au fost găsiți în ambele profiluri G. mellonella: C9: 0, C10: 0, C14: 0, C15: 0, C16: 1, C16: 0, C18: 1 și C18: 0. Șapte FFA detectate pe larvele crescute în dieta semi-artificială au fost absente în larvele crescute pe ceară de albine naturală: C4: 0, C5: 0, C6: 0, C7: 0, C8: 0, C14: 1 și C20: 1. Opt acizi grași au fost prezenți pe cuticula larvelor crescute în dieta naturală, dar au lipsit pe cele crescute în dieta semi-artificială: C12: 0, C17: 1, C17: 0, C18: 2, C21: 1, C22: 0, C24: 0 și C26: 0. În ambele profiluri, C16: 0 și C18: 1 au predominat.

În plus, s-a observat că FFA pe cuticula larvelor hrănite cu ceară de albine erau prezente în cantități mai mici decât insectele hrănite cu o dietă semi-artificială: aceste cantități totale fiind de 486,54 μg/g pentru larvele crescute în dieta Sehnal și 75,9 μg/g pentru cei crescuți pe ceară de albine, adică de șase ori mai mic.

S-au observat diferențe semnificative statistic între cele două grupuri în ceea ce privește cantitățile de FFA pe cuticulele lor (Tabelul 3). S-a constatat că larvele crescute pe ceară de albine au demonstrat de 65 de ori mai puțin acid tetradecanoic (C14: 0), de 12 ori mai puțin acid hexadecenoic (C16: 1), de 11 ori mai puțin acid hexadecanoic (C16: 0) și de patru ori mai puțini acizi octadecenoici (C18: 1) și octadecanoici (C18: 0) decât larvele crescute în dieta Sehnal. Cu toate acestea, comparând cotele procentuale ale fiecărui FFA individual în grupul tuturor FFA extrase în ambele grupuri de insecte, diferențele dintre ele nu mai sunt atât de marcate. De exemplu, concentrația de acid hexadecanoic (C16: 0) a fost de 11 ori mai mică în cuticulele larvelor hrănite cu ceară de albine decât cele hrănite cu dietă Sehnal, dacă este calculată ca μg/g corp de insectă; cu toate acestea, valoarea este doar de două ori mai mică atunci când este prezentată ca pondere procentuală în grupul tuturor FFA extrase. În mod similar, nivelul de acid octadecenoic (C18: 1) a fost de patru ori mai mic la larvele hrănite în mod natural atunci când a fost măsurat ca μg/g corp de insectă, dar doar de 1,8 ori mai mic când a fost măsurat ca procentaj (Tabelul 3).