Departamentul de Medicină pentru Afiliere, Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Universitatea din California San Diego, San Diego, California, Statele Unite ale Americii

bogată

Departamentul de afiliere pentru biologie, California State University San Marcos, San Marcos, California, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru gastroenterologie, Universitatea din California San Diego, San Diego, California, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru farmacologie, Universitatea din California San Diego, San Diego, California, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Medicină, Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Universitatea din California San Diego, San Diego, California, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Farmacologie, Universitatea din California San Diego, San Diego, California, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru biologie, California State University San Marcos, San Marcos, California, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Medicină pentru Afiliere, Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Universitatea din California San Diego, San Diego, California, Statele Unite ale Americii

  • Andrew M. F. Johnson,
  • Anne Costanzo,
  • Melanie G. Gareau,
  • Aaron M. Armando,
  • Oswald Quehenberger,
  • Julie M. Jameson,
  • Jerrold M. Olefsky

Cifre

Abstract

Dezvoltarea permeabilității intestinale și pătrunderea produselor microbiene sunt factori cheie asociați cu apariția bolilor metabolice. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza acestui lucru rămân neclare. Aici arătăm că, spre deosebire de ficat sau țesutul adipos, dieta bogată în grăsimi (HFD)/obezitatea la șoareci nu provoacă infiltrarea monocitelor/macrofagelor în intestin sau modificări pro-inflamatorii în expresia genelor. Mai degrabă HFD determină epuizarea eozinofilelor intestinale asociate cu debutul permeabilității intestinale. Numărul de eozinofile intestinale a fost restabilit prin readucerea șoarecilor hrăniți cu HFD la chow normal și au fost neschimbate la șoarecii cu deficit de leptină (Ob/Ob), indicând faptul că epuizarea eozinofilelor este cauzată în mod specific de o dietă bogată în grăsimi și nu de obezitate în sine. Analiza diferitelor aspecte ale permeabilității intestinale la șoarecii alimentați cu HFD și șoarecii Ob/Ob arată o asociere între epuizarea eozinofilelor și permeabilitatea paracelulară ileală, precum și scurgerea de albumină în fecale, dar nu permeabilitatea generală la dextranul FITC. Aceste descoperiri oferă primele dovezi că o dietă bogată în grăsimi provoacă epuizarea intestinului eozinofil, mai degrabă decât inflamația, care poate contribui la integritatea barierei defectuoase și la apariția bolilor metabolice.

Citare: Johnson AMF, Costanzo A, Gareau MG, Armando AM, Quehenberger O, Jameson JM, și colab. (2015) Dieta bogată în grăsimi determină epuizarea eozinofilelor intestinale asociate cu permeabilitatea intestinală. PLoS ONE 10 (4): e0122195. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0122195

Editor academic: Pratibha V. Nerurkar, Colegiul de Agricultură Tropicală și Resurse Umane, Universitatea din Hawaii, STATELE UNITE

Primit: 21 octombrie 2014; Admis: 13 februarie 2015; Publicat: 2 aprilie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Această lucrare a fost finanțată prin următoarele subvenții D.K.0033651, D.K.074868, D.K.063491 și D.K.09062 (J.O.). A.M.F.J. a fost susținut de o bursă de mentorat A.D.A (7-09-MN-37). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Pătrunderea bacteriilor sau a produselor bacteriene, cum ar fi LPS, peste bariera intestinală este asociată cu dezvoltarea inflamației cronice și a bolilor metabolice atât la oamenii obezi, cât și la șoareci [1,2,3,4,5,6]. Dovezile sugerează că reducerea expresiei proteinei de joncțiune strânsă și degenerarea integrității barierei epiteliale este o caracteristică a acestei permeabilități [4,7,8,9]. Cu toate acestea, mecanismele subiacente și asociate rămân mal definite.

Sistemul imunitar intestinal este o barieră imunologică eficientă împotriva infecției, bazată pe juxtapunerea sa către comunitatea extinsă de microorganisme denumită microbiota intestinală [10]. Într-adevăr, sistemul imunitar intestinal este adesea denumit „firewall” care împiedică pătrunderea sistemică a bacteriilor. Această funcție de barieră are implicații metabolice, deoarece semnalele microbiene în locații distincte de tractul gastrointestinal (GI) pot declanșa procese inflamatorii, cum ar fi cele care pot provoca rezistență la insulină. Într-adevăr, perfuzia intravenoasă cu niveluri scăzute de endotoxină pentru a imita penetrarea bacteriană este suficientă pentru a face șoarecii intoleranți la glucoză [2].

S-a sugerat anterior că o dietă bogată în grăsimi (HFD) sau obezitate are ca rezultat modificări pro-inflamatorii în ileon și colonul proximal al rozătoarelor, contribuind la permeabilitatea intestinală [11,12,13,14,15,16]. Aceste modificări includ focare de activare NF-κB și creșteri de 1,5-6 ori în expresia TNF-α și IL-1β [13,15,16]. Cu toate acestea, astfel de creșteri ale expresiei citokinelor nu au fost observate în toate studiile publicate [16] și nici analiza histologică, nici celulară a colonului nu a relevat răspunsuri pro-inflamatorii semnificative [14]. Analiza celulară a intestinului subțire la șoareci alimentați cu HFD rămâne nedeclarată.

Locuind în lamina propria, macrofagele, celulele dendritice (DC) și eozinofilele sunt populații predominante de celule. Populațiile intestinale de macrofage/DC reglează atât toleranța la microbiotă, cât și apărarea gazdei împotriva infecției. În mod specific, producția de macrofage/DC IL-10 și inducerea celulelor T (Treg) reglatoare pot promova toleranța, în timp ce epuizarea macrofagelor intestinale face șoarecii susceptibili la penetrarea bacteriană [17,18]. Deși destul de abundente, eozinofilele intestinale au fost studiate mai puțin pe larg. Eozinofilia poate fi o caracteristică a afecțiunilor inflamatorii specifice la șoareci și oameni, cum ar fi alergiile alimentare, gastroenterita eozinofilă, colita alergică și boala inflamatorie intestinală (IBD) [19,20,21]. În aceste condiții, recrutarea și extinderea eozinofilelor este promovată de citokine (de exemplu, IL-5) și chemokine (de exemplu, eotaxine) și joacă un rol activ în progresia bolii [19,20,21]. Cu toate acestea, eozinofilele rezidente în țesuturi pot, de asemenea, să promoveze repararea epitelială și funcția de barieră în timpul homeostazei [22,23,24]. Am căutat să stabilim dacă permeabilitatea intestinală observată la hrănirea cu HFD și obezitate este asociată cu modificări ale populațiilor intestinului subțire de macrofage/DC sau eozinofile.

Materiale și metode

C57Bl6/J și Ob/Ob au fost achiziționate de la laboratoarele Jackson, iar șoarecii CX3CR1GFP/+ [25] au fost crescuți intern și experimentele aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare animală al Institutului UCSD (IACUC). Șoarecii au fost menținuți pe o dietă normală de chow (Lab Diet 5001) pe un ciclu de lumină/întuneric de 12h/12h până la vârsta de 8-12 săptămâni înainte de transferul la o dietă bogată în grăsimi conținând 60% kcal de grăsimi (Research diets, New Brunswick, NJ, D12492) și analizate la momentele indicate. În studiile de comutare a dietei, șoarecii au primit HFD timp de patru săptămâni și au revenit la chow normal pentru alte 12 zile. După analiză, șoarecii au fost eutanasiați cu 75 mg/kg pentobarbital (Schering-Plough, Millsoboro, DE) de i.p. injecția și diafragma tăiată.

Albumină fecală ELISA

Peletele fecale au fost colectate înainte de aplicarea unei diete bogate în grăsimi (ziua 0) și în 3 zile următoare, au fost congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C. Peletele au fost resuspendate la 10 mg/ml în soluție salină tamponată cu fosfat steril (PBS) și concentrația de albumină determinată de ELISA în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Bethyl labs, Montgomery, TX, E90-134).

Test in vivo FITC Dextran

Permeabilitatea a fost determinată utilizând un protocol descris anterior [4]. Pe scurt, șoarecii au fost posti timp de 6 ore (7:00 - 13:00) și gavați oral cu 600 mg/kg 4kDa FITC dextran (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dintr-o soluție de 125 mg/ml. O oră mai târziu, 120 μl sânge a fost colectat, depozitat pe gheață în întuneric și centrifugat la 12000xg timp de 3 minute. Plasma a fost apoi diluată 1: 2 în PBS și concentrația dextranului FITC determinată prin spectroscopie de fluorescență (excitație la 485nm și emisie la 535nm) relativ la o curbă standard liniară realizată utilizând soluții diluate de dextran FITC în plasmă de la șoareci netratați.

Citometria în flux a leucocitelor laminei intestinale subțiri

Microscopie fluorescentă

Intestinul subțire a fost izolat, al treilea distal disecat și clătit cu PBS. Țesutul a fost apoi deschis longitudinal, rulat cu mucoasa spre exterior și încorporat în O.C.T. compus (Tissue-Tek, Sakura Finetek SUA, Torrance, CA). Secțiunile de 10 μm au fost tăiate folosind un criostat Leica (Buffalo Grove, IL) și fixate cu 4% formaldehidă fără metanol (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Secțiunile au fost imun colorate cu anticorpi direcționați împotriva CD11b (Biolegend, San Diego, CA), MHCII FITC (Biolegend, San Diego, CA) și Siglec F (BD Biosciences, San Jose, CA) și montate cu mediu SlowFade Gold Antifade care conține 4'- 6-Diamidino-2-fenilindol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Colorarea în tunel a fost efectuată folosind kitul de detectare a apoptozei TACS2 TgT-Flu In Situ (Trevigen, Gaithersburg) conform instrucțiunilor producătorului cu citonină utilizată pentru permeabilizare și cation de cobalt în reacția de etichetare. Imaginile au fost achiziționate digital (Zeiss AxioCam HRC, Thornwood, NY) și analizate utilizând software-ul Image J (rsb.info.nih.gov/ij/). Pentru cuantificarea celulei, lungimea vilozității a fost determinată utilizând instrumentul de măsurare software Image J și numărul de celule cuantificate per vilozități. Au fost folosiți trei persoane de șoareci per grup, cu minimum 20 de imagini achiziționate.

Studii de urmărire a monocitelor

Celulele mononucleare din sângele periferic au fost izolate din sângele șoarecilor donatori de tip sălbatic și monocitelor îmbogățite folosind trusa EasySep de îmbogățire a monocitelor de șoarece (tehnologii StemCell, Vancouver, Canada). Monocitele au fost marcate cu PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, PKH26GL), spălate de două ori în PBS și resuspendate la 2,5 x 107 celule per ml în PBS înainte de injecție. S-au injectat 200 μl (5 x 106 celule) i.v. retro-orbital. Proporțiile traficului către intestin au fost determinate 3-5 zile mai târziu prin izolarea celulară și citomeria de flux așa cum s-a descris mai sus.

Extracția ARN și PCR cantitativă

Intestinul subțire a fost deschis longitudinal, conținutul îndepărtat și mucoasa îndepărtată de musculare folosind o lamă de ras curată și ruptă congelată în azot lichid. ARN-ul a fost extras folosind Trizol (Life Technologies, NY) conform instrucțiunilor producătorului. 2μg ARN a fost convertit în ADNc utilizând un kit de conversie ADNc de mare capacitate (Life Technoliges, Applied Biosystems, NY). Expresia genică a fost măsurată prin PCR Quatnitative utilizând super mixul verde SYBR universitar iTAQ (Bio-Rad, Hercules, CA). Următoarele seturi de primeri au fost folosite pentru SYBR verde cantitativă RT-PCR (5'-3 „): β-actina FWD GGTTCTTTGCAGCTCCTTCGT, β-actina REV ATATCGTCATCCATCGCGAAC, CD11b FWD TGTGAGCAGCACTGAGATCC, CD11b REV ATGAGAGCCAAGAGCACCAG, CD11c FWD ACACAGTGTGCTCCAGTATGA, CD11c REV GCCCAGGGATATGTTCACAGC, TNFa FWD CCAGACCCTCACACTGAGATC, TNFα REV, CACTTGGTGGTTTGCTACGAC, IL-1β FWD CTTGGGATCCACACTCTCCAG, IL-1β REV AAATACCTGTGGCCTTGGGC, MCP-1 FWD AGGTCTCTGT.

Analiza eicosanoidă

Treimea cealaltă a intestinului subțire (ileonul) a fost cântărită, completată cu un cocktail format din 26 de standarde interne deuterizate, omogenizate cu 1 ml metanol 10% la 5 mg de țesut pe gheață și sonicat pe scurt. Probele au fost apoi purificate prin extracție în fază solidă pe coloane Strata-X (Phenomenex, Torrance, CA), urmând procedura de activare furnizată de distribuitor. Probele au fost eluate cu 1 ml metanol 100%, eluantul a fost uscat sub vid și dizolvat în 50 pl de tampon A constând din 60/40/0,02 apă/acetonitril/acid acetic = 60/40/0,02 (v/v/v ) și imediat utilizat pentru analiză. Eicosanoidele utilizate pentru standardele primare în curbele standard, precum și analogii lor deuterizați au fost de la Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI) și Biomol (Enzo Life Science, Framingdale, NY).

Eicosanoizii au fost analizați prin cromatografie lichidă în fază inversă, folosind o coloană BEH Shield de 1,7 uM 2,1x100 mm (Waters, Milford, MA) și un sistem Acquity UPLC (Waters, Milford, MA) și spectrometrie de masă, utilizând o masă AB SCIEX 6500 QTrap spectrometru echipat cu o sursă IonDrive Turbo V (AB SCIEX, Framingham, MA), așa cum s-a descris anterior. Eicosanoidele au fost cuantificate prin metoda stabilă de diluare a izotopilor utilizând curbe standard din standardele interne deuterizate. Pentru a calcula cantitatea de eicosanoizi dintr-un eșantion, s-au calculat rapoartele ariilor de vârf între eicosanoizi endogeni și eicosanoizi interni deuterizați. Raporturile au fost convertite în cantități absolute prin analiza de regresie liniară a curbelor standard generate în condiții identice.

Măsurarea permeabilității intestinale în camerele de utilizare

Rezultate

Dieta bogată în grăsimi determină apariția rapidă a permeabilității intestinale

După administrarea orală, concentrația de dextran FITC a fost mai mare la șoarecii hrăniți cu HFD timp de 7 zile comparativ cu martorii hrăniți cu chow (Fig. 1A), indicând o permeabilitate intestinală crescută așa cum s-a descris anterior [1,2,7,15,27]. Permeabilitatea intestinală poate fi, de asemenea, determinată prin analiza concentrației de albumină în fecale și am constatat concentrații crescute de albumină fecală încă de la o zi după HFD, comparativ cu șoarecii martori (Fig. 1B). Astfel, debutul permeabilității intestinale este un eveniment rapid după ingerarea unui HFD, care precede debutul obezității. În plus, am efectuat un experiment de timp pe șoareci hrăniți cu HFD și am constatat că apariția maximă a dextranului FITC în plasmă a avut loc la 1-2 ore după administrarea orală de dextran FITC (Fig. 1C), în concordanță cu permeabilitatea tractului gastro-intestinal superior. Din acest motiv, ne-am concentrat în mare parte pe răspunsul imun al intestinului subțire în studiile ulterioare.

După 1 săptămână HFD a existat o reducere marcată atât a proporției, cât și a numărului absolut de eozinofile din lamina propria, în timp ce macrofagele/DC au rămas neschimbate ca număr și astfel au fost proporțional crescute (Fig. 1E). Pentru a confirma aceste modificări, independent de procesul de digestie a colagenazei necesar izolării celulelor, am cuantificat eozinofilele și macrofagele/DC prin microscopie imunofluorescentă. Folosind această metodă la șoareci HFD de 7 zile, am constatat o scădere cu 67% a eozinofilelor (celule Siglec F +) per vilozitate, cu doar o modificare minoră a macrofagelor/DC (celule CD11b + MHCII +) (Fig. 1F). Aceste date furnizează primele dovezi că HFD determină o deficiență a sistemului imunitar intestinal asociată cu debutul permeabilității intestinale.

Dieta bogată în grăsimi nu provoacă inflamații intestinale

(A) CX3CR1 GFP/+ monocite/macrofage au fost cuantificate per villus prin microscopie imunofluorescentă. Mai multe vile au fost evaluate din> 30 de secțiuni cu 3 șoareci per grup. (B) Celulele laminei proprii au fost izolate după 1 săptămână sau 16 săptămâni HFD și populațiile de monocite au fost analizate ca celule vii, CD45 +, CD11b + Ly6C +. Fiecare punct de date reprezintă un mouse individual dintr-un experiment. (C) Traficul de monocite PKH26 + transferate adoptiv în intestin nu este îmbunătățit la șoarecii hrăniți cu HFD timp de 8 săptămâni. Sunt prezentate graficele reprezentative ale cometriei de flux ale unui control care primește PBS în locul monocitelor, șoarecilor receptori normali și șoareci primitori HFD. Graficul cu bare arată de la n = 6 șoareci per grup dintr-un experiment. D) Expresia genei inflamatorii în mucoasa intestinului subțire de 1 săptămână HFD sau șoareci chow normali. * p Fig 3. Dovezi ale unui defect al traficului de eozinofile la șoareci HFD.

(A) Secțiuni ileale de la șoareci chow normali sau șoareci HFD de 7 zile au fost colorate pentru celule apoptotice in situ folosind protocolul de colorare TdT-Fluor. Apoptoza minimă a fost detectată în ambele condiții în raport cu controlul pozitiv tratat cu nuclează. (B) Leucocitele din măduva osoasă și (C) din sângele periferic au fost izolate de la șoareci HFD de 5 săptămâni și proporțiile de eozinofile determinate prin citometrie în flux. D) Exprimarea genelor CCL11 și CCL24 în mucoasa intestinală subțire de 1 săptămână HFD sau șoareci chow normali. În toate graficele, fiecare punct de date reprezintă un mouse individual dintr-un experiment. * p Fig 4. Epuizarea eozinofilelor intestinale este cauzată de HFD, nu de obezitate.

(A) Celulele laminei proprii au fost izolate de la șoareci Ob/Ob vechi de 12 săptămâni și martori pentru colegii de gunoi sau (B) HFD hrănit, hrănit normal cu chow sau șoareci comutați de la HFD la chow normal (HFD-NC). Populațiile de eozinofile evaluate prin citometrie în flux așa cum se arată în Fig 1. Fiecare punct de date reprezintă un șoarece individual dintr-un experiment. * p Fig 5. Permeabilitatea intestinală comparată la șoarecii HFD și Ob/Ob.

Majoritatea studiilor asupra permeabilității intestinale asociate obezității au fost efectuate pe modele de rozătoare, unde se observă reproductibil o permeabilitate crescută cauzată de HFD sau obezitate [1,2,5,8]. La om, un studiu pilot nu a găsit nicio corelație între obezitate și permeabilitatea intestinală [38], în timp ce altul a găsit o asociere între permeabilitatea intestinului subțire și parametrii sindromului metabolic, cum ar fi talia și circumferința abdominală [6]. Interesant este că detectarea secvențelor de ADNr 16s în circulație ar putea fi predictivă a progresiei diabetului de tip II [3]. Aici arătăm că permeabilitatea intestinală apare rapid după hrănirea cu HFD, precedând apariția obezității. În plus, arătăm că, deși permeabilitatea generală la dextranul FITC poate fi observată la șoarecii obezi Ob/Ob în absența unui HFD, măsurători specifice asociate cu permeabilitatea paracelulară, cum ar fi scurgerea de albumină în fecale și conductanța transepitelială, sunt specifice Starea alimentată cu HFD.