A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Nikita Girish Deshpande, Juhi Saxena

dieta

Roluri Arhivarea datelor, Investigații, Scriere - schiță originală

Neuroștiințe de afiliere, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Nikita Girish Deshpande, Juhi Saxena

Roluri Arhivarea datelor, Investigații

Neuroștiințe de afiliere, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

Roluri Curarea datelor

Autori ‡ Acești autori au contribuit, de asemenea, în mod egal la această lucrare.

Neuroștiințe de afiliere, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

Roluri Curarea datelor, Scriere - schiță originală

Autori ‡ Acești autori au contribuit, de asemenea, în mod egal la această lucrare.

Departamentul de Afiliere Biologie, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

Roluri Arhivarea datelor, Investigații, Scriere - schiță originală

Autori ‡ Acești autori au contribuit, de asemenea, în mod egal la această lucrare.

Departamentul de Afiliere Biologie, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

Roluri Conceptualizare, supraveghere

Adresa actuală: Departamentul de Biologie, Universitatea Furman, 3300 Poinsett Highway, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere Biologie, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

Conceptualizarea rolurilor, curatarea datelor, analiza formală, achiziționarea de fonduri, administrarea proiectelor, supraveghere, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Adresa actuală: Departamentul de Biologie, Universitatea Furman, 3300 Poinsett Highway, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

Afiliații Neuroștiințe, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biologie, Universitatea Furman, Greenville, Carolina de Sud, Statele Unite ale Americii

  • Nikita Girish Deshpande,
  • Juhi Saxena,
  • Tristan G. Pesaresi,
  • Casey Dylan Carrell,
  • Grayson Breneman Ashby,
  • Min-Ken Liao,
  • Linnea Ruth Freeman

Cifre

Abstract

Citare: Deshpande NG, Saxena J, Pesaresi TG, Carrell CD, Ashby GB, Liao M-K și colab. (2019) Dieta bogată în grăsimi modifică microbiota intestinală, dar nu memoria spațială de lucru la șobolanii Sprague Dawley de vârstă mijlocie timpurii. PLoS ONE 14 (5): e0217553. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217553

Editor: Andras Bilkei-Gorzo, Universitatea din Bonn, GERMANIA

Primit: 14 decembrie 2018; Admis: 14 mai 2019; Publicat: 29 mai 2019

Disponibilitatea datelor: Toate fișierele de date Excel sunt disponibile de la FigShare la https://doi.org/10.6084/m9.figshare.7884839.v1.

Finanțarea: Cercetările raportate în această publicație au fost susținute de Institutul Național de Științe Medicale Generale din cadrul Institutelor Naționale de Sănătate sub numărul P20GM103499 (LRF). Conținutul este exclusiv responsabilitatea autorilor și nu reprezintă în mod necesar opiniile oficiale ale Institutelor Naționale de Sănătate. Finanțatorul nu a avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Prevalența obezității în rândul adulților din SUA este de peste 36% și a crescut semnificativ din anii 1980 [1]. Dieta este un factor semnificativ al stilului de viață în dezvoltarea diabetului, a hipertensiunii, a bolilor de inimă și a obezității. Dieta occidentală se caracterizează prin conținut ridicat de grăsimi saturate, colesterol și zahăr simplu [2-4]. Alternativ, dietele care includ pești, acizi grași n-3 și un raport ridicat de acizi grași polinesaturați și acizi grași saturați sunt asociați cu un risc redus de apariție a demenței [5]. Atât studiile epidemiologice la om, cât și studiile pe animale au fugit pentru a elucida efectele potențiale ale dietei asupra cunoașterii și mecanismele prin care apar aceste efecte. O revizuire cuprinzătoare a studiilor epidemiologice privind aportul de grăsimi și cunoașterea a găsit sprijin pentru ipoteza că dietele bogate în acizi grași saturați și acizii grași trans sunt asociați cu un risc mai mare de declin cognitiv și demență, în timp ce dietele bogate în grăsimi polinesaturate sau grăsimi mononesaturate sunt asociate cu risc scăzut de demență [6].

Obezitatea la vârsta mijlocie a fost corelată cu riscul crescut de a dezvolta demență la om [7]. Îmbătrânirea normativă implică un risc crescut de afectare cognitivă, dar consumul dietei occidentale poate exacerba această afectare cognitivă. Modelele animale sugerează că o dietă bogată în grăsimi afectează în mod semnificativ memoria și învățarea dependentă de hipocamp, indicând că aceasta poate fi un factor în riscul dezvoltării demenței [2, 3, 8, 9]. Cu toate acestea, mecanismele specifice prin care apare această influență rămân neclare.

Obiectivele acestui studiu au fost de trei ori: 1) determinarea efectelor unei diete bogate în grăsimi asupra memoriei spațiale de lucru, măsurată de labirintul brațului radial de apă la șobolanii Sprague Dawley de vârstă mijlocie, 2) evaluarea efectelor unei dietă grasă cu privire la abundența și diversitatea bacteriilor intestinale și 3) pentru evaluarea microgliozei ca indicator al neuroinflamării. Am emis ipoteza că o dietă bogată în grăsimi ar duce la un declin cognitiv din cauza disbiozei intestinale induse de dietă și a neuroinflamării ulterioare. Interesant este că nu am găsit o diferență semnificativă statistic în performanța labirintului brațului radial de apă sau microglioză între șobolanii Sprague-Dawley de vârstă mijlocie hrăniți cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (control) sau bogată în grăsimi. Cu toate acestea, am determinat modificări semnificative ale microbiomului intestinal. Prin urmare, aceste date indică posibilitatea unei disbioze intestinale fără declin cognitiv semnificativ sau neuroinflamare sub parametrii acestui studiu.

Materiale și metode

Animale și diete

Șobolanii Sprague-Dawley masculi (Envigo, Prattville, Alabama) au fost adăpostiți în vivariu, într-o cușcă, sub un ciclu de întuneric controlat de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric, cu acces ad libitum la alimente și apă. Șobolanii de vârstă mijlocie timpurii (vârsta de 7 luni; n = 6 per grup) au fost repartizați aleatoriu în grupul lor dietetic la începutul studiului. Șobolanii au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi (20% proteine, 35% carbohidrați, 45% grăsimi prin calorii; Research Diets # D12451), fie cu dietă controlată, cu conținut scăzut de grăsimi (20% proteine, 70% carbohidrați, 10% grăsimi prin calorii; Research Diets # D12450H) timp de opt săptămâni (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ). Dieta bogată în grăsimi furnizează 4,73 kilocalorii pe gram, iar cea slabă (dietă de control), care se potrivește cu dieta bogată în grăsimi pentru conținut de zaharoză (17% zaharoză), oferă 3,85 kilocalorii pe gram. Șobolanii au fost supuși unei evaluări cognitive în ultimele 2 săptămâni de tratament dietetic. Protocoalele pentru animale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire a animalelor de la Universitatea Furman și efectuate în conformitate cu liniile directoare de la Institutul Național de Sănătate. Greutatea corporală și consumul de alimente au fost măsurate în fiecare săptămână pe parcursul studiului. Probele de materii fecale au fost colectate la încheierea studiului folosind tehnica aseptică și depozitate într-un congelator de -80 ° C pentru analiză ulterioară.

Evaluarea cognitivă

Analiza probelor fecale

Probele fecale au fost trimise pentru secvențierea următoarei generații și analiza genului (MR DNA Labs, Shallowater, TX). Pentru această analiză, ADN-ul din aproximativ 200 mg din fiecare probă fecală a fost extras folosind PowerSoil ADN Kit de izolare (Qiagen, Redwood City, CA), iar ADN-ul extras a fost amplificat prin PCR final utilizând primerii Eubacterieni universali 16S 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA și 806R GGACTACHVGGGTTTCTCAT . ADN-ul amplificat a fost secvențiat utilizând pirozecvențierea ampliconului FLX codificat cu etichetă bacteriană așa cum este descris de Dowd și colab. 2008 [21]. Abundențele de genuri au fost raportate ca procente din bacteriile totale, iar analiza diversității a fost finalizată folosind Qiime (qiime.org).

Evaluarea imunohistologică

analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând software-ul GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA). Performanța labirintului brațului radial al apei a fost analizată utilizând un ANOVA bidirecțional pentru a evalua efectele principale ale dietei și efectele de interacțiune. Greutatea corporală și consumul de alimente au fost, de asemenea, analizate folosind un ANOVA bidirecțional pentru a evalua dieta x săptămână efectele principale și efectele de interacțiune. Numărul de celule microgiale a fost analizat folosind testul t Student. Analiza statistică pentru diversitatea bacteriilor intestinale este descrisă mai detaliat în secțiunea cu rezultate.

Rezultate

Consumul de alimente și modificarea greutății corporale

Consumul de alimente a fost evaluat săptămânal și apoi normalizat pentru caloriile consumate prin împărțirea gramelor consumate pe săptămână la kilocalorii pe gram specifice dietei. Dieta bogată în grăsimi oferă 4,73 kilocalorii pe gram, în timp ce dieta de control cu ​​conținut scăzut de grăsimi oferă 3,85 kilocalorii pe gram. Un efect principal al dietei (F (1,10) = 5.820, p = 0.0365), un efect principal al săptămânilor (F (7.69) = 38.76, p Fig 1. Consumul de alimente și greutatea corporală.

Consumul de alimente a fost semnificativ diferit între șobolanii cu conținut scăzut de grăsimi și șobolanii cu conținut ridicat de grăsimi pe parcursul celor 8 săptămâni. Greutățile corporale la începutul studiului nu au fost semnificativ diferite. Odată ce a început tratamentul dietetic, greutățile corporale au fost semnificativ diferite între grupuri pe tot parcursul studiului.

Diversitatea bacteriilor intestinale

După îngrijirea strictă a secvenței de calitate, un total de 1.318.811 secvențe au fost analizate și 1.122.322 au fost apoi grupate. 1.122.297 secvențe identificate în domeniile Bacteria și Archaea au fost utilizate pentru analizele finale ale microbiotei. Citirile medii pe eșantion au fost 93.524. Pentru analiza diversității alfa și beta, probele au fost rarefiate la 30.000 de secvențe și bootstrappate la 25.000 de secvențe. Matricile ponderate de distanță UniFrac au fost utilizate pentru a compara diversitatea beta a grăsimilor bogate și pentru a controla comunitățile microbiene intestinale alimentate cu diete și au prezentat semnificativ (p = 0,005) diferite asamblări filogenetice între cele două grupuri după dietă (Tabelul 1). Comparațiile statistice au fost efectuate folosind ANOVA, iar comparațiile post-hoc în perechi au fost făcute folosind testul lui Tukey. Am evaluat dacă vreun gen specific a fost semnificativ diferit între grupurile de tratament. A existat o gamă largă de genuri care s-au dovedit a fi semnificativ diferite între grupuri. Tabelul 1 afișează genurile care au avut abundențe relative semnificativ diferite pe baza grupului dietetic.

Sunt enumerate abundențele relative medii pentru genurile intestinale și valoarea p pentru diferențele dintre animalele cu conținut ridicat de grăsimi și cele de control. Clasa și filumul sunt, de asemenea, indicate. Acest tabel relevă genuri care au fost determinate a fi semnificativ diferite între grupurile dietetice. Genurile care nu sunt semnificativ diferite nu sunt listate din cauza numărului mare de microbi evaluați.

În timp ce s-a constatat o diferență semnificativă în numărul de specii observate între grupurile de tratament (diversitate alfa; p = 0,016), odată ce atât bogăția cât și uniformitatea au fost luate în considerare pentru utilizarea metricii diversității Shannon, nu s-a găsit nicio diferență semnificativă (p = 0,109). Comparațiile statistice au fost efectuate folosind testul Kruskal-Wallis și Steel-Dwass post-hoc pentru comparații multiple în perechi. Numărul de unități taxonomice observate a fost evaluat pentru fiecare dintre grupuri împreună cu indicele Shannon.

Comportamentul WRAM

Memoria de lucru corectă (A), memoria de lucru incorectă (B) și erorile de memorie de referință (C) pe parcursul celor 12 zile de testare sunt afișate între șobolanii cu conținut scăzut de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi. Nu au existat diferențe semnificative între grupul dietetic pentru oricare dintre erori. Nu au existat diferențe semnificative în viteza de înot, măsurată printr-un pre-test (D).

Microglia

Nu s-au observat diferențe semnificative statistic (p> 0,05) în numărul de microglii ramificate (în repaus) sau activate în oricare dintre regiunile creierului evaluate între șobolanii martori și cei cu greutate bogată în grăsimi (Fig. 3). Neocortexul și hipocampul dorsal au fost evaluate datorită rolului lor în învățare și în memoria spațială. Hipotalamusul a fost evaluat datorită rolului său în hrănire, metabolism și homeostazie.

Fig. A-C dezvăluie imagini reprezentative pentru șobolani cu conținut scăzut de grăsimi (martor). Fig 3D - 3F dezvăluie imagini reprezentative pentru șobolani cu conținut ridicat de grăsimi. Microglia activată și microglia ramificată (în repaus) au fost caracterizate și numărate de un cercetător orb de grupuri. Nu s-au găsit diferențe semnificative în microglia activată, ramificată sau totală între cele două grupuri dietetice.

Discuţie

Studiul actual a măsurat modificarea microbilor intestinali după consumul unei diete bogate în grăsimi sau de control, performanța pe labirintul brațului radial al apei și imunohistochimia Iba-1 în trei regiuni relevante ale creierului. Contrar ipotezei noastre, am observat modificări ale populațiilor de microbi intestinali fără efecte ulterioare asupra neuroinflamării sau a comportamentului memoriei de lucru.

Studiile anterioare au arătat, de asemenea, relații între dieta bogată în grăsimi, obezitate și disbioză în abundența relativă de Firmicutes și Bacteroidetes [12, 14, 16]. În plus, studiile anterioare au arătat modificări ale cunoașterii după consumul unei diete bogate în grăsimi [8, 9, 20, 22, 23].

Deși nu am observat diferențe în performanța WRAM, am fost intrigați să găsim modificări ale microbiomului intestinal fără modificări ale comportamentului. În 2015, Magnusson și colab. au constatat modificări semnificative ale microbiomului intestinal după consumul unei diete bogate în grăsimi sau a unei diete bogate în zaharoză, comparativ cu o dietă chow după doar două săptămâni. Șoarecii C57BL/6 în vârstă de două luni au fost hrăniți cu dieta pentru un total de 6 săptămâni și s-au efectuat teste comportamentale pe tot parcursul studiului. Șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în zaharoză au prezentat deficiențe în studiul sondaj în prima zi a testului Morris Water Maze, indicând unele modificări ale flexibilității cognitive și ale memoriei. Cu toate acestea, nu a existat niciun efect semnificativ al dietei asupra oricăruia dintre celelalte teste comportamentale efectuate în acest studiu, inclusiv: latență redusă și explorare în câmp deschis, recunoașterea obiectelor noi și celelalte studii pentru labirintul de apă Morris [24]. Prin urmare, oferim suport suplimentar pentru modificările microbiomului intestinal fără modificări ale memoriei spațiale de lucru. Cu toate acestea, studiul nostru s-a concentrat doar pe conținut ridicat de grăsimi versus conținut scăzut de grăsimi, iar studiul lui Magnusson a evaluat zaharoza ridicată versus zaharoză scăzută și grăsimea ridicată față de chow.

În concluzie, am determinat modificarea profilurilor microbilor intestinali după consumul unei diete bogate în grăsimi în comparație cu șobolanii hrăniți cu o dietă săracă în grăsimi (potrivite pentru zaharoză). Nu am observat performanțe modificate pe labirintul brațului radial de apă sau o activare microgliană crescută. Cu toate acestea, continuăm să presupunem un rol pentru disbioza microbiană intestinală în neuroinflamare și în declinul cognitiv ulterior. Vor fi necesare studii suplimentare pentru a determina dacă inflamația și declinul cognitiv urmează disbiozei microbilor intestinali. Pe baza descoperirilor recente efectuate la șoareci, continuăm să facem ipoteza acestei ordine de evenimente.