Abstract

OBIECTIV-Obezitatea este asociată cu anomalii endocrine care prezic progresia rezistenței la insulină la diabetul de tip 2. Deoarece s-a demonstrat că mușchiul scheletic secretă proteine ​​care ar putea fi utilizate ca biomarkeri, am caracterizat profilul proteic secretat al celulelor musculare derivate din extrem de obezi (IMC 48,8 ± 14,8 kg/m 2; evaluarea modelului homeostaziei [HOMA] 3,6 ± 1,0). pentru a se înclina subiecți sănătoși (IMC 25,7 ± 3,2 kg/m 2; HOMA 0,8 ± 0,2).

secreției

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE—Am emis ipoteza că mușchiul scheletic va secreta proteine ​​care prezic severitatea obezității. Pentru a testa această ipoteză, am folosit un proiect experimental „de jos în sus”, folosind etichetarea stabilă a izotopilor prin aminoacizi în cultură (SILAC) și cromatografie lichidă/spectometrie de masă/spectometrie de masă (LC-MS/MS) pentru a identifica și cuantifica proteinele secretate din miotuburi cultivați derivați de la extrem de obezi în comparație cu femeile sănătoase neobeze.

Caracteristicile clinice ale subiecților donatori pentru cultura celulelor musculare

Marcarea stabilă a izotopilor și colectarea proteinelor secretate.

Identificarea și cuantificarea LC-MS/MS a 13 C6-Lys și a proteinelor secretate nemarcate din miotuburile umane primare slabe și extrem de obeze. A: Proteinele din mediul condiționat de 18 ore, fără ser din miotuburi nemarcate (slabe) și 13 C6-Lys (extrem de obeze) au fost combinate 1: 1 și rezolvate cu 4-16% SDS-PAGE. B: Cromatograful de vârf de bază care arată intensitățile globale ale vârfului și timpul de retenție al tuturor peptidelor extrase dintr-o felie de gel între 37 și 15 kDa. C: O peptidă care eluează la 31,8 minute ca dublet la m/z 706,4 și 709,4, corespunzător peptidei C6-Lys nemarcate și 13 din GAPDH uman. Secvența peptidică prezentată în partea de sus a spectrului a fost obținută prin analiza MS/MS. Peptidele marcate și nemarcate sunt distanțate la 3 Da într-un raport 1: 1 și sunt de acord cu un reziduu de 13 C6-Lys din peptida dublă încărcată. (Vă rugăm să consultați http://dx.doi.org/10.2337/db08-0943 pentru o reprezentare digitală de înaltă calitate a acestei figuri.)

LC-MS/MS, identificarea proteinelor și cuantificarea.

Identificarea LC-MS/MS și cuantificarea proteinei miostatine secretate. A: Spectrul superior prezintă un dublet peptidic la m/z 571,8 și 574,8 corespunzător peptidelor nemarcate și 13 C6-Lys din miostatină umană. Peptidele marcate și nemarcate sunt distanțate la 3 Da într-un raport de 3: 1 și sunt de acord cu un reziduu de 13 C6-Lys din peptida dublă încărcată. Secvența peptidică prezentată în partea de sus a spectrului a fost obținută prin analiza MS/MS a peptidei fragmentate. B: Afișate cu caractere aldine și subliniate sunt pozițiile relative ale celorlalte peptide miostatine identificate în secvența primară a miostatinei umane.

Analiza Western blot a mediului condiționat, a mușchiului scheletic și a plasmei.

Nivelurile de proteină miostatină în mediile condiționate, celulele musculare, întregul mușchi scheletic și plasma au fost verificate folosind imunoblotul occidental. Pentru a colecta proteinele secretate pentru cuantificarea nivelurilor de miostatină, celulele (miotuburile de 9 zile) au fost spălate de cinci ori cu PBS și incubate cu Optimem fără ser (Invitrogen) timp de încă 24 de ore, după cum s-a descris anterior (18,19). Mediul Optimem conține factori de creștere care promovează supraviețuirea celulelor cu incubații extinse și este conceput special pentru caracterizarea proteinelor secretate. Mediul condiționat a fost decantat în tuburi de 50 ml (BD Biosciences Falcon), centrifugat la 300 g și apoi la 1.000 g și filtrat printr-un filtru de nailon de 0,22 μm (Millipore) înainte de o centrifugare finală de 100 000 g pentru a elimina resturile celulare rămase. Mediile condiționate au fost apoi congelate rapid în azot lichid și liofilizate sub vid și apoi precipitate cu acid tricloracetic 10% urmate de mai multe spălări cu acetonă -20 ° C așa cum s-a descris anterior (18). În total, 50 μg de proteine ​​au fost colectate pe probă, separate prin SDS-PAGE și transferate în membrana Immobilon-P PVDF (Millipore).

Pentru analiza Western blot a nivelurilor de miostatină în mușchi, mușchiul scheletos pulverizat cu azot sau miotuburile au fost extrase folosind tampon digitonină (10 mmol/l Tevi, 0,015% digitonină, 300 mmol/l zaharoză, 100 mmol/l NaCl, 3 mmol/l MgCl2, EDTA de 5 mmol/l și inhibitor de protează de 1 mmol/l [fluorură de fenilmetilsulfonil], pH 6,8) cu inversare ușoară la 4 ° C timp de 40 min (20). Acesta a fost apoi centrifugat la 8.000 g timp de 20 de minute pentru a îndepărta resturile celulare insolubile. Concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind reactivul colorant pentru testul proteinei Bio-Rad, urmând instrucțiunile producătorului (Bio-Rad, Hercules, CA). Douăzeci de micrograme de proteină celulară (19,21) au fost apoi separate prin SDS-PAGE și transferate la membrana Immobilon-P PVDF (Millipore). Membranele au fost colorate cu Ponceau S pentru a confirma eficiența egală a încărcării și transferului.

Pentru a analiza proteinele plasmatice pentru analiza Western blot, 2 μl de plasmă s-a diluat 1:10 în PBS și 100 μg de proteine ​​au fost încărcate pe geluri SDS-PAGE cu gradient de 4-12% (Invitrogen) și transferate în membrana Immobilon-P PVDF (Millipore ). Anticorpul primar utilizat în acest studiu a fost un anticorp policlonal anti-miostatină (R&D Systems, Minneapolis, MN) crescut împotriva Escherichia coli - derivat, miostatin de șoarece întreg recombinant la capre. Am ales acest anticorp specific atât pentru capacitatea sa de a detecta în mod fiabil miostatina umană, cât și pentru a neutraliza activitatea miostatinei într-un test biologic. Anticorpul principal utilizat pentru a detecta gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost un anticorp monoclonal de șoarece (Abcam, Cambridge, MA). Membranele au fost incubate în 1/1000 în anticorp primar în soluție salină tamponată Tris cu Tween timp de 20 ore la 4 ° C. După spălare, anticorpii primari au fost detectați folosind peroxidază de hrean - anticorpi secundari anti-capră conjugată (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) la o diluție de 1/5000 și un substrat chemiluminiscent SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL). Imaginile au fost achiziționate și cuantificate folosind un sistem de bioimaginare ChemiGenius (Syngene, Frederick, MD).

Testul proliferării myoblastelor.

Pentru a evalua activitatea biologică a proteinei secretate de miostatină în medii condiționate, am folosit un test de proliferare a mioblastelor așa cum s-a descris anterior, care se bazează pe capacitatea miostatinei de a inhiba progresia mioblastelor de la faza G1 la S-a ciclului celular ( 18, 22). Pe scurt, celulele au fost însămânțate la 1.000 de celule/godeu în plăci cu 96 de godeuri (Nunc Nalgene, Rochester, NY) în mediu de creștere condiționat de 48 de ore (DMEM plus 10% FBS) din celule musculare umane derivate de la trei subiecți slabi și extrem de obezi . Patruzeci și opt de ore s-a dovedit a fi suficient timp pentru acumularea de miostatină secretată în medii condiționate (18,22). Ca martor, celulele au fost, de asemenea, proliferate în medii condiționate care au fost preincubate cu 20 μg/ml anticorp anti-miostatină sau în mediu de creștere necondiționat. Această concentrație de anticorp anti-miostatină a fost demonstrată de producător (sisteme de cercetare și dezvoltare) pentru a neutraliza până la 30 ng/ml proteină activă de miostatină. La intervale zilnice pe o perioadă de 4 zile, mioblastele proliferante au fost tripsinizate și densitățile celulare au fost determinate (în cvadruplet) folosind un hemocitometru (Hausser Scientific, Horsham, PA).

analize statistice.

Pentru comparații din abundența miostatinei în mușchi și plasmă, am folosit un test t independent cu distribuție cu două cozi, cu nivelul de semnificație stabilit la P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Lista proteinelor identificate în mediile condiționate ale miotuburilor umane primare