Abstract

Principalele scopuri ale studiului au fost i) dezvoltarea unei prime populații de cartografiere a grâului de pâine cultivat în Kazahstan, ii) construirea hărții sale genetice pentru identificarea ulterioară a genelor asociate cu trăsături agronomice importante.

hărți

Din câte știm, aceasta este prima populație segregatoare și o hartă genetică dezvoltată pentru grâul de pâine kazah. Lucrarea este un exemplu al modului în care programele de creștere a plantelor din Kazahstan au început cu succes implementarea metodelor de creștere a plantelor de generația următoare.

Tehnologia KASP (Compatative Allele Specific PCR) a grupului LGC și a markerilor ADN SNP au fost exploatate pentru a genotipa și a construi o hartă genetică a populației segregatoare. Lungimea totală a hărții a fost de 1376 cM. Un total de 157 din cei 178 de markeri SNP folosiți inițiali au format 26 de grupuri de legături, lăsând 1 markeri duplicați și 20 de markeri neatribuiți. Distanța de prag între markeri a fost stabilită ≤ 30 cM. Prin urmare, s-au obținut două grupuri de legătură pentru cromozomi precum 2A, 2B, 2D, 3A, 5A, 6B și 7A. În ciuda unui marker duplicat și 20 de neatribuiți, cei 157 de markeri KASP SNP care au fost mapați acopereau genomurile A, B și D ale grâului. Funcția de mapare Kosambi a fost utilizată pentru a calcula unitățile de recombinare între producători. RIL-urile au fost dezvoltate prin metoda SSD până la generația F4. Aproape 97% din alelele identificate au fost utile în evaluarea diversității genetice a populației; restul de 3% nu au prezentat niciun rezultat. Ca rezultat, 77 de markeri ADN au fost mapați pentru A, 74 pentru B și 27 pentru genomii D. Populația de cartografiere va fi genotipată folosind un plan de matrice de densitate mare a markerului, cum ar fi Illumina iSelect, pentru a obține o hartă genetică cu o acoperire relativ mare. Apoi, populația și harta genetică de înaltă rezoluție vor fi utilizate pentru a identifica genele care influențează adaptarea grâului în Kazahstan.

Introducere

Grâul este o cultură de cereale. În ciuda faptului că există multe teorii ușor diferite despre originea sa, Semiluna Fertilă este considerată în principal a fi locul în care grâul a provenit și a fost domesticit (CW 1995) (Nesbitt și Samuel 1998) (Gustafson, Raskina și colab. 2009 ).). Cele trei genomi (AABBDD) de grâu hexaploid (Triticum aestivum L. ssp. Aestevium) derivate din diploid (DD) Aegilops tauschii și tetraploid (BBAA) sălbatic (Triticum turgidum L. (Tell), ssp. Dicoccoides) care la rândul său au moștenit genomul său AA de la Triticum urartu diploid și BB fie de la Aegilops speltoides diploide, fie de la alte specii dispărute (Wang, Luo și colab. 2013) (Feldman, Liu și colab. 1997). De la cultivarea pâinii, grâul a fost o cultură de mare importanță, care furnizează în prezent 20% din caloriile populației mondiale (Bushuk 1997). Prin urmare, grâul de pâine hexaploid (2n = 6x = 42) cu cel mai complex genom și originea istoriei este o cultură vitală pentru hrană și furaje din lume. Importanța sa este deosebit de ridicată în Kazahstan, deoarece i) majoritatea produselor alimentare locale constau din făină de grâu (Eken, Spanbayev și colab. 2016) ii) Kazahstanul este unul dintre cei trei mari exportatori mondiali de grâu, clasat în prezent ca unul dintre cele patru marii exportatori de grâu, care sunt cunoscuți în mod colectiv ca țările „coșului de pâine” din lume, împreună cu Ucraina și Rusia (Swinnen, Burkitbayeva și colab. 2017).

Materiale și metode

Dezvoltarea segregării/cartografierii populației

Extracția ADN-ului din RIL-urile Pam x Par și prepararea ADN-ului pentru genotipare utilizând KASP

Pentru a extrage ADN din liniile consangvinizate recombinate, cinci semințe din fiecare linie au fost semănate în cutii Petri și puse timp de 2 zile la 4 ° C pentru stratificare. După aceea, au fost transferați într-un incubator cu furii de temperatură de 27-30 ° C timp de 5-6 zile pentru germinare. Metodologia Dellaporta (Dellaporta, Wood și colab. 1983), cu modificări, a fost utilizată pentru a izola ADN-ul de răsaduri de grâu vechi de 5-6 zile. ADN-ul genomic extras a fost supus unei purificări ulterioare utilizând coloane de spin Qiagene Mini. Calitatea și cantitatea (A260/A280) de ADN extras au fost evaluate în spectrofotometru Nanodrop cu vizualizare suplimentară pe geluri de agaroză 1% pentru a evalua integritatea. ADN-ul fiecărui RIL a fost standardizat la o concentrație de 10 ng/μl pentru genotipare utilizând platforma KASP. Principala prioritate a platformei de genotipare KASP față de sistemele vechi este aceea că nu necesită mult timp pentru vizualizarea produsului PCR. Prin urmare, a atenuat enorm o metodă veche de vizualizare care consuma mult timp, electroforeza pe bază de gel, care utilizează substanțe chimice umede mutagene, cum ar fi bromura de etidiu. În plus, folosind tehnologia KASP pot fi detectate și inserții, ștergeri și modificări unice ale bazei (o nucleotidă) în genomi, ceea ce îl face un instrument puternic pentru a înlocui vechea metodă plictisitoare.

Construcția hărții genetice

Inițial, mai mult de trei sute de markeri ADN SNP proiectați de Universitatea Bristol (informațiile despre markerii ADN pot fi obținuți aici www.cerealsdb.uk.net (Wilkinson, Winfield și colab. 2012)) au fost folosiți pentru genotipul Pamyati Azieva și Paragon. Acest lucru indiferent dacă acei markeri moleculari au fost sau nu polimorfi. Odată ce au fost identificați markeri polimorfi care distingeu părinții genetic, aceștia au fost folosiți pentru a genotipa populația RIL. Pentru a construi harta de legătură genetică a RIL-urilor, software-ul MapDisto a fost utilizat inițial (http://mapdisto.free.fr/) (Heffelfinger, Fragoso și colab. 2017). Cu toate acestea, distanța hărții genetice a fost re-estimată utilizând un mediu software omnibus R. Motivul este că R este un instrument flexibil pentru a efectua calcule statistice pentru setul de date pentru a îmbunătăți calitatea hărții genetice. În ambele cazuri, funcția de mapare Kosambi (Kosambi 2016) a fost utilizată pentru a calcula fracțiile de recombinare și apoi pentru a converti unitățile în centiMorgans. Logaritmul cotelor (scor LOD) nu a fost mai mic de trei. În total, 72 de markeri moleculari SNP au fost mapați pentru A, 67 pentru B și doar 19 pentru genomii D, arătând importanța dezvoltării mai multor markeri polimorfi pentru genomul D pentru a-și desfășura potențialul genetic pentru analiza asocierii marker-trăsături. Nu au fost mapate markeri pentru cromozomii 3D și 4D ai grâului (Tabelul 1).

Tabelul oferă numărul de markeri, lungimea, distanța medie între markeri și distanța maximă dintre markeri, pentru fiecare cromozom sau grupuri de legături din analiză. Nu au fost mapate markeri pentru cromozomii 3D și 4D ai grâului.

Distanța de prag a fost stabilită nu mai mare de 30 cM între markerii ADN de-a lungul grupurilor de legătură (LG). Prin urmare, au fost obținute două LG-uri dacă există o lungime mai mare de 30 cM între doi markeri ADN învecinați în analiză pereche. Cu alte cuvinte, dacă fracția de recombinare între doi markeri> 0,30%, s-au format mai multe grupuri de legătură.

Statistici de bază

Rezultate

Dezvoltarea populației și construirea hărții genetice

Aici, raportăm dezvoltarea unei populații segregatoare derivată din încrucișarea soiurilor de grâu Paragon și Pamyati Azieva, în special linii consangvinizate de consangvinizare (RIL), precum și construirea primei hărți genetice a RIL-urilor în colaborare între John Innes Center (JIC), Regatul Unit și Institutul de Biologie și Biotehnologie a Plantelor (IPBB), Kazahstan. Acest lucru este demn de remarcat, deoarece aceasta este prima populație de cartografiere dezvoltată și hartă genetică construită vreodată, care implică cultivar de grâu adaptat la principalele medii de creștere a grâului din Kazahstan, utilizând tehnologia modernă de marcare moleculară. Ca rezultat, s-au obținut 94 de linii consangvinizate consangvinizate, iar lungimea totală a hărții genetice construite a fost de 1376 cM. Numărul total de markeri SNP KASP mapați a fost de 157, care se află pe 26 de grupuri de legături. Cel mai mare grup de legătură a fost grupul de legătură 1 pentru cromozomul 1A cu dimensiunea hărții de 174 cM. În schimb, grupul de legătură 3 pentru cromozomul 1D a fost cel mai mic ca dimensiune, cu doar 1 cM. Grupul de legătură 17, cu un total de 133 cm dimensiune a hărții și 23 cm de spațiere maximă, a fost cel mai dens, atribuind 15 markeri moleculari (Tabelul 1 și S.5). Un număr total de markeri neatribuiți a fost de 20 (nu este afișat).

Izolarea ADN-ului

ADN-ul a fost extras din răsaduri vechi de cinci și șase zile crescute într-un incubator cu un interval de temperatură de 20-22 ° C. În ceea ce privește rezultatele Nanodrop (datele nu sunt furnizate), cantitatea de ADN izolat a fost în medie mai mare de 100 μl/ng, iar calitatea a variat între 1,8 - 2,0 (A260/A280) după purificare cu coloane de spin Qiagene Mini. Deoarece KASP necesită o concentrație mai mică de ADN pentru a seta PCR în comparație cu PCR obișnuit, ADN-ul fiecărei linii recombinante a fost diluat separat cu apă distilată pentru a face ADN-ul cu concentrația finală de 10 ng/μl.

Statistici generale

Rezumatul funcției () a arătat că tipul de cruce era „riself” așa cum era de așteptat, cu o semnificație a RIL obținută prin auto-fertilizare. Deoarece distanța de prag între markeri a fost setată să nu fie mai mare de 30 cM, s-au obținut două grupuri de legătură pentru cromozomi precum 2A, 2B, 2D, 3A, 5A, 6B și 7A. Prin urmare, numărul total de cromozomi a fost de 26 și de markeri genotipați a fost de 157, excluzând unul dintre cei doi markeri duplicat, BS00090234 și BS00022781, cu genotipuri de markeri identici. Acești markeri duplicat localizați pe grupul de legătură 2B2 au fost identificați prin funcția findDupMarkers () și unul, în special BS00022781, a fost omis din analiza ulterioară utilizând drop.markers (). Astfel, harta construită conținea 26 LG și anume 1A (cu 10 markeri ADN SNP), 1B (11), 1D (2), 2A1 (6), 2A2 (3), 2B1 (2) 2B2 (7), 2D1 (4), 2D2 (5), 3A1 (5), 3A2 (2), 3B (13), 4A (9), 4B (3), 5A1 (10) 5A2 (5), 5B (15), 5D (4), 6A (11), 6B1 (5), 6B2 (2), 6D (2), 7A1 (3), 7A2 (8), 7B (8) și 7D (2) (Tabelul 1).

Pentru a desena harta genetică cu toate alelele și genotipurile lipsă ca hartă de căldură s-a folosit funcția geno.image (), dar datele au fost tratate ca generație F2. Ca urmare a trasării punctelor de date, a existat un nivel acceptabil scăzut de genotipuri lipsă observate atât pentru indivizi, cât și pentru markeri, prin urmare nu a existat niciun motiv pentru a nu scăpa nici indivizii, nici markerii (FIG.1). Rețineți că ar trebui să citiți setul de date în R ca generare f2 pentru a trasa toate alelele și datele lipsă pentru liniile consangvinizate obținute prin auto-fertilizare. Dacă setul de date este tratat ca linii consangvinizate auto-fertilizate, programul prezintă heterozigoții ca genotipuri lipsă. Prin urmare, s-ar putea ajunge la mai multe date lipsă în setul de date. Funcția plotMissing () din pachetul R-QTL ar putea fi utilizată pentru a implementa aceeași analiză, dar nu oferă informații haplotipice (alelice). Prin urmare, prezintă doar genotipurile care lipsesc și, prin urmare, vă recomandăm să aplicați geno.image () pentru a oferi o imagine întreagă a hărții.

Harta de căldură genetică: roșu, albastru și verde se referă la alelele AA, BB și respectiv AB. Lacunelor albe le lipsesc genotipurile. De-a lungul părții superioare și inferioare axa x, grupurile de legătură și respectiv marcatorii sunt situate. Liniile orizontale de sus în jos împart grupurile de legături. Probele sunt plasate pe axa y.

Rata de succes a genotipării a fost de 96,5%, cu 3,5% din datele lipsă. Luat procentul genotipat ca fiind 100%, ponderea alelelor AA și BB ar fi reprezentat 47,7%, respectiv 47,2%, ceea ce este aproape același cu restul de 5,1% din heterozigoți (AB) (FIG.2 și S.4). Graficul numărului de markeri genotipați/lipsă pentru fiecare individ și al numărului de probe genotipate/lipsă pentru fiecare producător care utilizează funcția ntyped () a arătat în mod clar că aproape toți indivizii au fost genotipați cu mai mult de 140 de markeri din 157 cu o excepție din doar trei indivizi, PamxPar-89, PamxPar-49 și PamxPar-48, care au avut 135, 136 și respectiv 137 markeri genotipați. A existat un singur marker, BS00060014, cu peste 30 de genotipuri/probe lipsă din 94 (FIG.3 și S.1). Acest lucru confirmă faptul că nu trebuie să omitem niciun individ și niciun marker din analiză, deoarece acele date minore lipsă (genotipuri lipsă atât pentru individ, cât și pentru marker) nu ar trebui să cauzeze dificultăți.

Proporția alelelor AA și BB a fost aproape aceeași (47,7%, respectiv 47,2%). Spre deosebire de acestea, genotipurile AB au constituit doar 5,1%, așa cum era de așteptat în F4, sugerând că populația a fost în mare parte fixată la majoritatea markerilor.

Ca rezultat al funcției de comparare, am văzut că liniile consangvinizate derivate din încrucișarea PamxPar au aproximativ genotipuri de aproximativ 45% la markeri. De asemenea, am putea vedea indivizi cu genotipuri foarte asemănătoare, cu peste 90%. În plus, au fost identificați acei indivizi cu genotipuri aproape similare, RIL30 cu RIL31 (cu 92,3% genotipuri), RIL58 cu RIL61 (90,1%) și RIL41 cu RIL62 (90,2%) (FIG.4 și S.2).

Numărul de markeri genotipați pentru fiecare eșantion (stânga) și numărul de indivizi genotipați pentru fiecare marker (dreapta).