Sumaira Sharif

1 Departamentul de Biochimie, Universitatea de Agricultură, Faisalabad 38000, Pakistan

sălbatice

Muhammad Shahid

1 Departamentul de Biochimie, Universitatea de Agricultură, Faisalabad 38000, Pakistan

Muhammad Mushtaq

2 Departamentul de chimie, Government College University, Lahore 54000, Pakistan

Sumia Akram

3 Departamentul de chimie, Universitatea Kinnaird College for Women, Lahore 54000, Pakistan

Ayoub Rashid

2 Departamentul de chimie, Government College University, Lahore 54000, Pakistan

Abstract

Această lucrare descrie în detaliu compoziția proximă, profilul nutrițional, constituenții fitochimici, activitățile antioxidante, potențialul antimicrobian și activitatea antihemolitică (față de eritrocitele umane) a diferitelor fracțiuni de Ganoderma lucidum sălbatic. Analiza apropiată a stabilit că G. lucidum sălbatic cuprinde aproximativ 87,02 ± 5,45% din umiditate, iar partea rămasă este o sursă bogată de proteine ​​(8,59 ± 0,37%), fibre brute (54,21 ± 1,2%) și carbohidrați (35,16%) cu conținut mai mic de grăsimi (3,33%). În mod similar, screening-ul fitochimic a relevat prezența flavonoidelor (217,51 ± 0,30 mg/g), acid ascorbic (116 ± 7,32 mg/g), fenolici (360,72 ± 34,07 mg/g), β-caroten (0,42 ± 0,04 μg/g) și licopen (0,05 ± 0,00 μg/g). Extractele de G. lucidum sălbatic în diferiți solvenți au asigurat prima linie de protecție împotriva Escherichia coli și Pasteurella multocida în ordinea acetatului de etil> etanol> metanol> n-hexan> apă. Mai mult, s-a constatat că extractele apoase și metanolice de G. lucidum sălbatic sunt sigure pentru eritrocitele umane. În general, ciupercile sălbatice (G. lucidum) s-au dovedit a fi o bună sursă de suplimente alimentare, agenți antimicrobieni și antioxidanți în scopul utilizării sale comerciale în industria alimentară și farmaceutică.

INTRODUCERE

Genul Ganoderma cuprinde peste 50 de specii, iar puține dintre acestea au fost desemnate ca ciuperci medicinale datorită beneficiilor lor stabilite pentru sănătate (1) și a potențialelor terapeutice (2). Speciile Ganoderma lucidum, cunoscute în mod obișnuit ca Reishi sau Mannentake (japoneză) și Ling Zhi (chineză) (3), sunt frecvent utilizate ca ciuperci medicinale datorită atributelor lor nutriționale și medicinale. Ganoderma lucidum a fost, de asemenea, utilizat ca remediu popular pentru promovarea sănătății și a devenit „regele ierburilor” pentru longevitate în țările asiatice (4). Recent, conștientizarea beneficiilor pentru sănătate ale dietelor bogate în antioxidanți naturali a dezvoltat curiozitatea în cercetători, părți interesate și consumatori datorită profilului fitochimic și antioxidant al diferitelor surse medicinale și dietetice (5).

În acest context, G. lucidum a fost investigat pe larg ca o sursă bogată de peste 500 de bioactivi, inclusiv fenolici, flavonoizi, terpenoizi, peptide și steroizi (6). Sa afirmat că prezența acestor compuși conferă beneficii vizibile pentru sănătate și potențial preventiv alimentelor comestibile (7). Mulți cercetători au descoperit că diferite părți ale ciupercilor posedă efecte antimicrobiene (8), antivirale (9), imunomodulatoare (10), care favorizează somnul, hipolipidemice (11) și hepatoprotectoare (12). Extractele de G. lucidum din diferiți solvenți s-au dovedit a fi anti-diabetici, antioxidanți și radicali liberi (13). Rapoartele citate mai sus indică faptul că extractele de G. lucidum ar putea fi o sursă excepțională de fitomedicine și alimente funcționale. Cu toate acestea, există dovezi neconcludente că extractele apoase de G. lucidum pot provoca efecte dăunătoare asupra viabilității celulare și pot crește riscurile de sângerare (14). Prin urmare, ar fi mai practic să se evalueze date fiabile cu privire la activitatea anti-hemolitică a ciupercilor sălbatice (G. lucidum), împreună cu profilul nutrițional, fitoconstituenții majori și minori, caracterul antioxidant și activitățile antimicrobiene.

MATERIALE ȘI METODE

Colectare de ciuperci

G. lucidum utilizat în acest studiu a fost colectat din Salmalia malabaria cultivată în vecinătatea Universității de Agricultură și identificată de Institutul de Științe Horticole, Universitatea de Agricultură, Faisalabad, Pakistan.

Produse chimice, standarde și solvenți

Standardele includ acid galic, acid ascorbic, catehină și hidroxitoluen butilat, reactivi care conțin reactiv Folin-Ciocalteu, metafosforic, 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) și acid tricloracetic și substanțe chimice care conțin Na2CO3, AlCl3, NaNO2, 2,6-dicloroindofenol (DCPIP) și fericianură de potasiu au fost procurate de la Sigma Chemicals (St. Louis, MO, SUA). Solvenții folosiți în cercetarea actuală, adică metanolul (MeOH), etanolul (EtOH), acetat de etil (EtAC) și n-hexan au fost de calitate analitică și au fost furnizate de Merck (Darmstadt, Germania). Agar nutrienți (NA), agar dextroză din cartofi (PDA) și soluție salină izotonică tamponată cu potasiu (PBS) au fost furnizate de Oxoid Ltd. (Hampshire, Marea Britanie).

Analiza proximă a ciupercilor

Probele au fost analizate pentru compoziția imediată (umiditate, proteine, grăsimi și cenușă) folosind metodele standard ale American Oil and Chemists Society (15), în care carbohidrații au fost determinați prin diferență. Pe scurt, proteina brută (CP) a probelor a fost estimată prin metoda macro-Kjeldahl. Grăsimea brută (CF) a fost determinată prin extragerea unei greutăți cunoscute de probă sub formă de pulbere cu eter de petrol. Pentru a cuantifica conținutul de cenușă (AC), o cantitate cântărită de G. lucidum a fost incinerată la 600 ± 15 ° C. Glucidele totale au fost calculate utilizând următoarea ecuație: TC = 100– (M + AC + CP + CF). Energia a fost calculată conform următoarei ecuații: Energie (kcal) = 4 × (g proteine ​​+ g carbohidrați) + 9 × (g grăsimi) (16).

Pregătirea extractelor

Extractele din G. lucidum au fost preparate în diferiți solvenți (MeOH, EtOH, EtAC, apă și n-hexan) conform Gangadevi și Muthumary (17) cu ușoare modificări. Pe scurt, 20 g probă de ciuperci sălbatice sub formă de pulbere a fost amestecată cu 200 ml din fiecare solvent și păstrată într-un agitator orbital (120 rpm la 37 ° C) peste noapte. Extractele obținute după trecerea suspensiilor prin hârtie de filtru Whatman nr. 4 au fost concentrate într-un evaporator rotativ (seria N-N, EYELA, Tokyo, Japonia) și depozitate la 4 ° C pentru utilizare ulterioară.

Fitochimia extractelor de ciuperci

Conținutul fenolic total (TPC)

TPC a fost determinat folosind acid galic ca standard de calibrare. În acest scop, 12 concentrații diferite de acid galic (2

100 ppm) și extractul de plante (5 mg) au fost amestecate separat cu reactiv Folin-Ciocalteu. Alicotele au fost adăugate la 800 pl de Na2CO3 700 mM și incubate la temperatura camerei timp de 2 ore. În cele din urmă, 200 μL din fiecare probă au fost transferate pe o placă cu 96 de godeuri și absorbanta a fost măsurată la 765 nm. TPC a fost calculat ca echivalenți de acid galic (mg GAE)/g substanță uscată (18).

Conținut total de flavonoizi (TFC)

TFC a fost determinat prin modificarea testului documentat anterior al lui Cao și colab. (19). Pe scurt, 5 mg din extract s-au dizolvat în 10 ml de apă distilată și s-au tratat cu 0,3 ml de NaNO2 5%. După 5 min, s-au adăugat 0,6 mL de 10% AlCI3 și s-au incubat la temperatura camerei timp de încă 5 min. În cele din urmă, alicota a fost amestecată cu 2 ml de NaOH 1 M, diluată corespunzător și absorbanta înregistrată la 510 nm. Rezultatele au fost exprimate ca echivalenți de catehină (mg CE/g).

Conținut de acid ascorbic

de Quirós și colab. (20) au documentat un test colorimetric rapid și fiabil pentru determinarea acidului ascorbic în sucurile de fructe. Urmând această metodă, 100 μL din soluția de extract (1%) a fost amestecată cu 10 μL de acid metafosforic 1%, incubată la temperatura ambiantă timp de 45 de minute și apoi tratată cu 10 μL de DCPIP. Absorbanța a fost măsurată la 515 nm, păstrând acidul L-ascorbic ca standard de referință.

β-caroten și licopen

În acest eseu, 100 μl de extracte de ciuperci au fost transferate la 1 ml de tub de microcentrifugă de propilenă diluat cu 10 μL de amestec acetonă-hexan (4: 6 v/v) și au fost agitate energic timp de un minut. Soluția a fost filtrată prin hârtie de filtru Whatman nr. 4 și absorbanta a fost înregistrată la 453, 505 și 663 nm. Conținutul de β-caroten și licopen a fost calculat folosind următoarele ecuații:

Alcaloizi, taninuri, glicozide, terpenoide și saponine

Prezența altor clase de fitochimicale, inclusiv alcaloizi, taninuri, glicozide, terpenoide și saponine, a fost verificată urmând metodele documentate de Chouhan și Singh (21).

Activitate antimicrobiană

Microorganisme testate

Activitatea antimicrobiană a extractelor de ciuperci sălbatice a fost evaluată în raport cu un grup de microorganisme cuprinzând 4 tulpini bacteriene: E. coli, P. multocida, Staphylococcus aureus și Bacillus subtilis și 4 tulpini fungice: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Furasium solani și Alternaria alternta. Tulpinile bacteriene și fungice au fost cultivate pe NA peste noapte la 37 ° C și PDA timp de 48 de ore la 28 ° C, respectiv.

Testul antimicrobian prin metoda de difuzie a discului

Activitatea antimicrobiană a extractelor de ciuperci a fost determinată prin metoda de difuzie a discului (22). Pe scurt, 100 μL din inoculat a fost adăugat la mediu (NA și PDA au fost amestecate și autoclavizate), transferate în plăci Petri și lăsate să se solidifice. Pe el au fost plasate discuri mici de hârtie de filtru cu probă de 100 μL și incubate la 37 ° C și 28 ° C timp de 24 h și respectiv 48 h. Diametrele zonelor de inhibare au fost măsurate în milimetri cu ajutorul unui cititor de zone. Rezultatele au fost comparate cu agentul antimicrobian standard rifampicină.

Concentrații minime inhibitorii (CMI) ale extractelor de ciuperci

O singură colonie de bacterii a fost transferată în bulion, incubată și rotită într-o centrifugă. Supernatantul a fost aruncat, iar reziduul de pelete a fost centrifugat din nou până a devenit limpede. Peleta a fost în cele din urmă suspendată în soluție salină și diluată pentru a obține o concentrație de 5 × 106 CFU/ml. Apoi, 100 μL de extracte de ciuperci au fost pipetate în primul rând al unei plăci sterilizate cu 96 de godeuri. La toate celelalte godeuri, s-au adăugat 50 μL de bulion nutritiv. Diluțiile seriale au fost efectuate astfel încât fiecare godeu să aibă 50 μL de material de testat în ordine descendentă de concentrație. La fiecare godeu s-au adăugat 10 μl soluție indicator de resazurină. În cele din urmă, s-au adăugat 10 μL de suspensie bacteriană (5 × 106 CFU/mL) pentru a obține o concentrație de 5 × 105 CFU/mL. Plăcile au fost apoi incubate la 37 ° C timp de 12 ore. Absorbanta a fost masurata la 500 nm. Cea mai mică concentrație la care apar modificările de culoare a fost luată ca valoare MIC (23).

Potențial antioxidant

Activitate de eliminare a radicalilor liberi

Capacitatea antiradicală a extractelor de ciuperci a fost evaluată prin simplificarea unui test dezvoltat anterior (24). 50 mg cântărit cu precizie de extract de ciuperci s-a dizolvat în 100 ml de MeOH și diferite concentrații ale acestei soluții au fost incubate la temperatura camerei cu 0,004% soluție de MeOH de DPPH. După 10 minute, absorbanța a fost citită pe un semifabricat la 517 nm. Concentrația extractului care furnizează 50% inhibare (IC50) a fost calculată din procentul de inhibare reprezentat grafic față de concentrația extractului.

Reducerea puterii

Puterea de reducere a extractelor de ciuperci a fost evaluată în funcție de puterea lor de reducere ferică (25). La 100 μL de diferite concentrații de extracte (1

5 mg), s-au adăugat 1,0 ml tampon fosfat de sodiu/fosfat de potasiu 0,2 M (pH 6,6) și 1,0 ml fericianură de potasiu (1,0%) și amestecul a fost incubat la 50 ° C timp de 20 min. Soluția rezultată a fost amestecată cu 5 ml de acid tricloracetic (10%) și centrifugată la 1.000 rpm timp de 10 min. Stratul superior al soluției a fost colectat și diluat cu o cantitate adecvată de apă distilată și 1,0 ml de clorură ferică (0,1%). Absorbanta citita la 700 nm a masurat direct puterea de reducere.

Inhibare hemolitică

Sângele uman prelevat aseptic a fost heparinizat, centrifugat și spălat de trei ori cu soluție izotonică sterilă de PBS răcită (pH 7,4). Celulele spălate au fost suspendate în soluție tampon PBS cu soluție salină răcită de 20 ml și numărul de eritrocite a fost efectuat folosind un hemocitometru. Măsurate cu precizie, 20 pl de extract de ciuperci (1,0%) și 180 pl suspensie de celule sanguine diluate au fost plasate într-o baie de gheață timp de 5 minute. Triton X-100 (0,1%) și PBS au fost luate ca martor pozitiv și respectiv negativ. În fiecare experiment, 2 ml tub conținând 20 μL de probă (extract, martor pozitiv sau negativ) și 180 μL de suspensie de celule sanguine diluate au fost din nou centrifugate timp de 5 minute la 1.500 g. După centrifugare, 100 μL de supernatant a fost luat și diluat cu 900 μL de PBS răcit. Toate probele au fost decongelate și 200 μL de alicot au fost pipetate într-o placă cu 96 de godeuri. Absorbanța a fost înregistrată la 576 nm folosind μQuant ™ (BioTek® Instruments, Inc., Winooski, VT, SUA) și s-a calculat procentul de liză (26).

analize statistice

Datele au fost obținute ca medie ± deviație standard (SD) a experimentelor triplicate cu un nivel de încredere de 95%. Statistic, o diferență semnificativă între valorile medii ale diferiților parametri a fost determinată prin analiza varianței (ANOVA). Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul statistic Minitab, versiunea 16.0 (Minitab Pty Ltd., Sydney, Australia) (27).

REZULTATE SI DISCUTII

Compoziție apropiată

Rapoarte de cercetare cuprinzătoare privind compoziția apropiată a G. lucidum sălbatic, în special cele care obișnuiesc în regiunile tropicale, sunt rare. Rezultatele prezentei cercetări (Tabelul 1) au arătat că pulberea uscată de G. lucidum sălbatic găzduită în planta S. malabaria este o sursă bogată de fibre brute (54,21 ± 1,20%), proteine ​​(8,59 ± 0,37), cenușă (3,78 ± 0,06) și grăsime (3,33 ± 0,33%). Mai mult, G. lucidum sălbatic conținea o cantitate substanțială de carbohidrați totali (35,16 g/100 g de substanță uscată). Valorile energetice ale G. lucidum sălbatic au fost calculate pentru a fi de 244,97 kcal/100 g de substanță uscată. Compoziția apropiată a G. lucidum sălbatic a fost de acord cu cele cultivate în sudul Vietnamului (28). Acest raport a indicat că G. lucidum cuprinde 13,3 ± 0,1% proteine, 3,0 ± 0,1% grăsimi și 1,4 ± 0,1% cenușă. În general, compoziția apropiată a G. lucidum sălbatic a fost găsită comparabilă cu anumite fructe importante din punct de vedere nutrițional și medical (29), fasole (30), orez și anumite alimente noi (31).

tabelul 1

Compoziție apropiată de Ganoderma lucidum sălbatic (unitate: g/100 g)

ParametersValue
Umiditate87,02 ± 5,45 1)
Proteine ​​brute8,59 ± 0,37
Grăsime brută3,33 ± 0,33
Fibră brută54,21 ± 1,20
Frasin3,78 ± 0,06
Glucide totale35,16 ± 0,24
Energia totală (kcal)244,97 ± 1,89

Valorile sunt medii ± SD ale experimentelor triplicate.