Jurnalul Internațional al

antimicrobiene

Articol Științe Moleculare

Candidați la proteine ​​antimicrobiene din geobacilul termofil sp. Strain ZGt-1: Producție, Proteomică și Analiză Bioinformatică Rawana N. Alkhalili 1, Katja Bernfur 2, Tarek Dishisha 1,3, Gashaw Mamo 1, Jenny Schelin 4, Björn Canbäck 5, Cecilia Emanuelsson 2 și Rajni Hatti-Kaul 1, * 1

Biotehnologie, Departamentul de Chimie, Universitatea Lund, Lund SE-221 00, Suedia; [e-mail protejat] (R.N.A.); [e-mail protejat] (T.D.); [email protected] (G.M.) Center for Molecular Protein Science, Departamentul de Chimie, Universitatea Lund, Lund SE-221 00, Suedia; [e-mail protejat] (K.B.); [email protected] (C.E.) Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Facultatea de Farmacie, Universitatea Beni-Suef, Beni-Suef 62511, Egipt Microbiologie Aplicată, Departamentul de Chimie, Universitatea Lund, Lund SE-221 00, Suedia; [e-mail protejat] Departamentul de biologie, grupul de ecologie microbiană, Universitatea Lund, Lund SE-221 00, Suedia; [email protected] Corespondență: [email protected]; Tel.: + 46-46-222-4840; Fax: + 46-46-222-4713

Editor academic: Már Másson Primit: 17 iunie 2016; Acceptat: 12 august 2016; Publicat: 19 august 2016

1. Introducere Concurența pentru nutrienți și spațiu într-un habitat dat determină organismele să-și dezvolte propriile strategii de supraviețuire și creștere, dintre care una este secreția de substanțe antimicrobiene care are ca rezultat uciderea sau afectarea creșterii organismelor concurente [1]. Aceste substanțe antimicrobiene posedă o valoare clinică și industrială promițătoare [2]. În zilele noastre, problema tot mai mare a rezistenței la mai multe medicamente și scepticismul în creștere cu privire la utilizarea aditivilor chimici în produsele alimentare au dus la

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016; doi: 10.3390/ijms17081363

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

unele bacterii gram-negative pot dezvolta mecanisme specifice speciilor pentru a elimina efectul AMP în anumite condiții de mediu [16-18]. Mai mult, variațiile în structura LPS, în special în lipida A, între diferitele bacterii influențează afinitatea AMP și inserarea în membrana exterioară [16,17]. De exemplu, există diferențe în lanțurile polizaharidice și în Lipid A Sci. între coli și S. typhimurium; acesta din urmă are un acid gras suplimentar și diferite Int. J. Mol. 2016, 17, E. 1363 3 din 17 substituenți ai grupărilor fosfat din lipida A [19].

Figura 1. Activitatea antibacteriană a Geobacillus sp. tulpina ZGt-1 împotriva (a) tulpinei G. stearothermophilus 10; Figura 1. Activitatea antibacteriană a Geobacillus sp. tulpina ZGt-1 împotriva (a) tulpinei G. stearothermophilus 10; (b) B. subtilis; și (c) S. typhimurium CCUG 31969. Săgețile sunt îndreptate către zona de inhibare. (b) B. subtilis; și (c) S. typhimurium CCUG 31969. Săgețile sunt îndreptate către zona de inhibare.

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Figura 2. Activitatea antibacteriană a supernatantului fără celule obținută prin cultivarea secvențială în serie a celulelor imobilizate ale Geobacillus sp. ZGt-1 împotriva tulpinii G. stearothermophilus 10 la 60 ◦ C, la sfârșitul ciclului (a) nr. 1; (b) ciclul # 5; (c) ciclurile # 11, 12 și 13; (d) ciclurile # 14, 15, 16 și 17; (e) ciclurile # 24 și 25. Punctul galben indică locul unde a fost observat supernatantul; și (f) Rezumatul activității antibacteriene pe parcursul celor 25 de cicluri, numărul de simboluri + reprezentând un grad crescut de activitate antibacteriană.

2.4. Proteinele antimicrobiene produse prin tratamentul cu tulpină ZGt-1 Protease ne-au dat o indicație a activității antimicrobiene care trebuie asociată cu proteinele. Prin urmare, am procedat la izolarea proteinelor din supernatantul fără celule colectate din loturile secvențiale cu celule ZGt-1 imobilizate prin precipitare cu sulfat de amoniu. Precipitatul proteic obținut cu o saturație de sare de 60% a fost dializat împotriva apei distilate și activitatea sa antibacteriană a fost confirmată folosind metoda spot-on-gazon (Figura S1). Activitatea sa dovedit a fi stabilă după încălzire la 70 ◦ C timp de 45 de minute, dar a fost pierdută la încălzire la 80 ◦ C timp de 10 min

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

(Figura S2). Proteinele din probă au fost rezolvate pe SDS-PAGE și gelul a fost supus testului de activitate antibacteriană (Schema 1). O zonă corespunzătoare masei moleculare de 15-20 kDa a afișat zona de inhibare cu G. stearothermophilus (Figura 3 și Figura S3). Int. J. Mol. Știință. 2016, 17, 1363 5 din 17

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Schema 1. Fluxul de lucru pentru identificarea potențialilor candidați proteici antimicrobieni în Geobacillus sp.

Schema 1. Fluxul de lucru pentru identificarea potențialilor candidați proteici antimicrobieni în Geobacillus sp. ZGt-1: Extract de proteină sărată din Geobacillus sp. ZGt-1 a fost fracționat prin SDS-PAGE, urmat de ZGt-1: prin extract desalinizat de pe Geobacillus sp. ZGt-1 a fost fracționat de urmat de Schemeprotein 1. antibacterian Flux de lucru pentru identificarea potențialului candidat la proteine ​​antimicrobiene (M.O.) în Geobacillus sp. detectarea gelului împotriva microorganismului de testare și a SDS-PAGE, analiza ZGt-1: Extract de proteină sărată din Geobacillus sp. ZGt-1 a fost fracționat prin SDS-PAGE, urmat de detectarea activității antibacteriene pe gel împotriva microorganismului de testare (M.O.) și analiza zonei active prin spectrometrie de masă. S: eșantion, M: marker proteic în desenele animate SDS-PAGE în activ prin detectarea activității antibacteriene pe gel împotriva microorganismului de testare (M.O.) și analiza detaliilor experimentale sunt furnizate în text. schema zonei. prin spectrometrie de masă. S: eșantion, M: markerul proteic din desenele animate SDS-PAGE din schemă. zona activă prin spectrometrie de masă. S: eșantion, M: marker proteic în desenele animate SDS-PAGE din detaliile experimentale sunt furnizate în text. sistem. Detaliile experimentale sunt furnizate în text.

zonă atribuită activității antibacteriene a fracției proteice. Zona de inhibare a corespuns cu 15-20 kDa.

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Tabelul 1. Proteine ​​(10-30 kDa) identificate prin spectrometrie de masă. ID-ul interogării

Denumirea proteinei omoloage 2

2_80 23_398 4_30 23_103 23_493 23_703 28_65 23_775 25_145 4_4 6_35 18_68 23_393 6_3 23_103 13_48 23_492 6_3 23_103 23_843 28_41 18__184_1

253 469 488 219 243 258 219 403 517 241 293 610 231 803 866 267 357 314 432 406 208 315

17.118 16.072 20.475 22.862 15.718 23.554 17.987 19.041 16.846 19.549 17.044 16.741 20.528 21.126 18.266 23.049 16.545 27.457 19.025 13.884 27.963 19.432

2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfat sintază 6,7-Dimetil-8-ribitilumazin sintază ATP sintază subunitate b Proteină capsidă Proteină capsidă Deoxiriboz-fosfat aldolază Proteina familiei DinB Flagelină Proteină conservată hipotetică Menaquinol-citocază-sulf N5-carboxiaminoimidazol ribonucleotidă Nucleozid difosfat kinază Peptidă deformilază Peroxiredoxină Probabilă tiol peroxidază Probabilă transaldolază Proteină indusă de înfometare controlată de σ-B Trioză fosfat izomerază-proteină canterizată Familia necaracter Proteină Uncharacter

G8N0X9 L8A0J9 G8MZV8 A0A0K9I0I6 A0A0K9I0I6 A0A063YQK6 U2WSJ5 L8A2E4 Q5KWM5 S7U299 Q5L3D8 G8MZM9 Q5L138 Q5KWS6 Q5KW

Greutatea moleculară teoretică bazată pe secvența de aminoacizi; 2 Cele mai bune accesări ale căutărilor UniProt BLASTp, toate valorile electronice au fost semnificative și mult mai mici sau egale cu 0.

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Tabelul 2. Predicția potențialului antimicrobian al proteinelor necaracterizate pe baza proprietăților lor fizico-chimice și a modelelor algoritmice. Proprietăți fizico-chimice ID interogare proteină

129 13,8927 +2 8,80 14,04 80,08 −0,044 1,12 5,3 3 40% Da ≥38

153 16,8564 +2 8,61 17,61 110,33 −0,257 1,57 −6,6 6 39% Da ≥42

173 18.979,1 +1 7,72 36,7 96,76 −0,253 1,19 −2,4 6 36% Da ≥31

1.000 1 0.987 1 1.000 1 NAMP 2

1.000 1 0.9575 1 1.000 1 AMP 3

1.000 1 0.991 1 1.000 1 NAMP 2

Lungime Greutate moleculară (kDa) Încărcare netă pI Indice de instabilitate Indice alifatic Indice GRAVY Indice Boman (kcal/mol) Na4 vSS Numărul de regiuni de puncte fierbinți agregate Raport total hidrofob Potențial de formare a elicei amfipatice Număr de reziduuri hidrofobe pe aceeași parte Modele algoritmice

Rezumatul parametrilor potențiali antimicrobieni îndepliniți deduși din proprietățile fizico-chimice și algoritmii de predicție Proprietăți fizico-chimice Algoritmi de predicție

1 Probabilitatea de a fi o peptidă/proteină antimicrobiană; 2 Peptidă/proteină non-antimicrobiană; 3 Peptidă/proteină antimicrobiană.

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

3.4. Detectarea activității antibacteriene a Geobacillus sp. ZGt-1 3.4.1. Metoda Agar-Defered Spot Pentru determinarea activității antibacteriene prin această metodă, mai multe bacterii au fost utilizate ca tulpini de testare, inclusiv o tulpină termofilă strâns legată Geobacillus stearothermophilus (tulpina 10), izolată de aceeași nișă de mediu și mezofilă Bacillus subtilis TMB94 și tulpini bacteriene patogene, E. coli 1005, S. aureus NCTC 83254, S. epidermidis TMB96, S. typhimurium CCUG 31969 și P. vulgaris TMB02. Culturile bacteriene au fost striate pe plăci de agar MH care au fost incubate peste noapte la 60 și respectiv 37 ◦ C. Coloniile tulpinilor respective au fost apoi suspendate în soluție salină sterilă (0,85% greutate/NaCl) și utilizate pentru a însămânța agar moale MH (0,5 ×) preîncălzit la 55 ◦ C în cazul G. stearothermophilus sau la 45 ( C pentru mezofili, astfel încât OD550 final a fost

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Int. J. Mol. Știință. 17, 1363 2016

Abrevieri Amidase AMP ANN APD3 CAMPR3 DA DD -carboxipeptidaza DTT GREY LPS LC-MS/MS meso-DAP MH Na4 vSS NAMP PG pI RF SVM

N-acetilmuroamoil-L-alanină amidază Peptidă antimicrobiană/proteină Rețea neuronală artificială Bază de date peptidă antimicrobiană Colecția peptidelor antimicrobiene Analiză discriminantă Serină tip D-alanil-D-alanină carboxipeptidază Ditiotreitol Cultură mare de hidropatic mediu Media normalizată a înclinației agregării Peptidă/proteină non-antimicrobiană Peptidoglican Punct izoelectric Păduri aleatorii Mașini vectoriale de sprijin