ABSTRACT

INTRODUCERE

Nutriția este unul dintre cei mai importanți factori de mediu care determină atât creșterea, cât și dezvoltarea organismelor. Nutrienții alimentari nu sunt necesari doar pentru respirație și metabolism pentru a alimenta creșterea și dezvoltarea, ci și pentru a furniza elemente chimice esențiale utilizate pentru construcția țesuturilor și creșterea generală. Astfel, nutriția servește ca o condiție sine qua non atât pentru creștere, cât și pentru dezvoltare și modelează variația fenotipică, cum ar fi dimensiunea corpului (Chown și Nicolson, 2004; Simpson și Raubenheimer, 2011). În ciuda importanței sale centrale, rolurile anumitor componente nutriționale joacă în creșterea și dezvoltarea generală nu sunt bine caracterizate în multe organisme, iar interacțiunile neliniare dintre componentele dietetice specifice fac nutriția dificil de studiat (Raubenheimer și colab., 2009). Cadrul geometric pentru nutriție oferă o abordare standardizată pentru studierea efectelor nutriției și un cadru conceptual robust pentru explorarea efectelor complexității nutriționale asupra performanței și fitnessului (Behmer, 2009a, b; Harrison și colab., 2014; Raubenheimer și Simpson, 1994, 1999; Simpson și Raubenheimer, 1995, 2001, 2011). Acest cadru permite cercetătorilor capacitatea de a desface efectele macronutrienților majori, cum ar fi proteinele și carbohidrații, și surprinde în mod robust complexitatea efectelor nutriționale asupra creșterii.

nutriție

La insectele holometabolice, nutriția larvelor joacă un rol critic în modelarea fenotipurilor adulte (Boggs, 2009; O'Brien și colab., 2002, 2005). Multe aspecte ale fenotipului adulților se fixează la metamorfoză (Boggs, 2009), ceea ce poate duce la varianță în morfometria adultului legată de performanță și reproducere (Chown și Gaston, 2010; Emlen și Allen, 2003; Shingleton și colab., 2009; Stern și Emlen, 1999). Poate că cele mai izbitoare exemple de plasticitate mediată nutrițional apar la himenopterele eusociale, care se dezvoltă în două sau mai multe caste fenotipice distincte, în funcție de diferențele în calitatea sau cantitatea proviziilor nutriționale în timpul dezvoltării juvenile (Hartfelder și colab., 2006; Hrassnigg și Crailsheim, 2005; Libbrecht și colab., 2013; Linksvayer și colab., 2011; Wheeler și colab., 2014). Astfel, himenopterii eusociali pot fi deosebit de sensibili la compoziția nutrițională a surselor alimentare larvare.

Tehnicile de creștere in vitro necesare pentru manipularea sistematică a dietelor larvare în A. mellifera s-au dovedit provocatoare și, prin urmare, nu au fost utilizate pe scară largă. Progresele recente în creșterea in vitro (Aupinel și colab., 2005; Crailsheim și colab., 2013; Kaftanoglu și colab., 2011; Linksvayer și colab., 2011) fac posibilă aplicarea cadrului geometric la nutriția larvelor albinelor. În acest studiu, folosim creșterea in vitro pentru a determina modul în care rapoartele proteine, carbohidrați și proteine ​​× carbohidrați afectează supraviețuirea, rata de creștere și timpul de dezvoltare în timpul etapei larvare. Ambele proteine ​​și carbohidrați sunt principalii macronutrienți ai dietei pentru albine (Haydak, 1970), afectează creșterea atunci când sunt manipulate separat (Asencot și Lensky, 1977; Brouwers și colab., 1987) și au fost în centrul altor studii care utilizează cadrul geometric din himenopterii adulți (Dussutour și Simpson, 2012; Paoli și colab., 2014; Pirk și colab., 2010). Am formulat nouă diete cu conținut diferit de proteine ​​și carbohidrați folosind lăptișor de matcă comercial și zaharuri. Am crescut larve in vitro și am analizat supraviețuirea, rata de creștere și timpul de dezvoltare folosind regresii neliniare și peisaje de performanță. Am constatat că larvele supraviețuiesc și cresc într-o gamă largă de condiții nutriționale și au existat interacțiuni neașteptate între componentele dietei care au modificat ratele de creștere a larvelor, dar nu timpul de dezvoltare.

REZULTATE

Analiza conținutului de lăptișor de matcă și a conținutului de nutrienți ai dietelor artificiale

Conținutul de proteine ​​din lăptișorul de matcă a fost de 12,35%. Materialul neproteic din jeleu a fost de 27% carbohidrați și 56% apă. Folosind aceste valori, am calculat conținutul relativ de proteine, carbohidrați și apă, precum și raportul dintre proteine ​​și carbohidrați din diferitele noastre tratamente dietetice (Tabelul 1).

Conținutul de proteine, carbohidrați și apă calculat și raporturile proteine ​​/ carbohidrați pentru nouă diete artificiale și numărul asociat de persoane care au supraviețuit și au murit pentru fiecare tratament dietetic (n = 24 per grup)

Supraviețuirea la diferite tratamente dietetice

Conținutul de proteine, conținutul de carbohidrați și interacțiunea dintre conținutul de proteine ​​și carbohidrați au avut efecte semnificative asupra supraviețuirii (Tabelul 2). Proteinele nu au avut un efect neliniar semnificativ asupra supraviețuirii, deoarece termenul pătratic a fost nesemnificativ în această analiză. Cu toate acestea, supraviețuirea a fost semnificativ afectată de conținutul de carbohidrați într-o manieră neliniară, deoarece termenul pătratic din modelul nostru a avut un efect semnificativ (Tabelul 2).

Efectele statistice ale componentelor nutriționale asupra supraviețuirii, ritmului de creștere și timpul de dezvoltare

Supraviețuirea a fost cea mai mare în general în tratamentul cu proteine ​​medii pentru combinațiile de carbohidrați scăzut, mediu și ridicat (Fig. 1A). Când conținutul de proteine ​​al dietei artificiale a crescut, supraviețuirea a scăzut cu aproximativ 60% în medie în combinațiile de carbohidrați scăzut, mediu și ridicat (Fig. 1A). Cu toate acestea, supraviețuirea a variat în ceea ce privește diferitele tratamente cu carbohidrați atunci când proteinele au fost reduse. În condiții de proteine ​​scăzute, supraviețuirea a rămas ridicată în combinație cu tratamentul cu carbohidrați redus, dar a scăzut la 0 pe măsură ce conținutul de carbohidrați adăugat a crescut (Fig. 1A). Aceste tipare au fost susținute în continuare atunci când supraviețuirea a fost mapată pe un peisaj de performanță pentru concentrațiile de proteine ​​și carbohidrați (Fig. 1B). Mortalitatea la concentrații ridicate de proteine ​​a fost independentă de concentrația de carbohidrați (Fig. 1B).

Valori de creștere larvară și peisaje de performanță ca răspuns la diferite conținuturi de proteine ​​și carbohidrați din alimente. Proporția indivizilor care au supraviețuit până la stadiul prepupal (A, B), rata medie de creștere GR (C, D) și timpul de dezvoltare TD (E, F) al larvelor A. mellifera crescute pe diferite tratamente de dietă artificială. Proteinele cu conținut scăzut de proteine ​​(LP, cercuri), proteine ​​medii (MP, pătrate) și proteine ​​cu conținut ridicat (HP, diamante) sunt separate prin linii. Pentru fiecare nivel de tratament cu proteine ​​sunt prezentate combinații cu conținut scăzut de carbohidrați (LC, alb), carbohidrați medii (MC, gri) și cu conținut ridicat de carbohidrați (HC, negru). Barele de erori reprezintă erori standard de proporții (A) sau erori standard ale mijloacelor (C, E) pentru fiecare tratament, în timp ce literele din panourile grafice indică diferențe semnificative post hoc între tratamente, consultați textul pentru descrieri ale testelor post hoc adecvate (P Vizualizați acest lucru masa:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

Rețete de diete artificiale utilizate în acest studiu

Lăptișorul de matcă conține mulți macronutrienți esențiali și vitamine, inclusiv carbohidrați și lipide importante pentru nutriția larvelor (Wang și colab., 2015). Lăptișorul de matcă este principala sursă naturală de proteine ​​pentru dezvoltarea larvelor de A. mellifera, astfel încât acest studiu a manipulat conținutul de jeleu al alimentelor artificiale ca un proxy pentru manipularea conținutului de proteine. Conținutul de carbohidrați a fost modificat simultan prin creșterea sau scăderea cantității totale de glucoză și fructoză adăugate la jeleu. Un raport 1: 2 dintre glucoză și fructoză a fost utilizat în toate tratamentele dietetice (Tabelul 3), dar s-au adăugat cantități absolute diferite pentru a crea condiții ridicate, medii și scăzute de carbohidrați. Tratamentele cu proteine ​​și carbohidrați au fost complet încrucișate, rezultând nouă diete diferite (Tabelul 3). Pentru toate dietele din acest studiu, am omogenizat toate ingredientele timp de 10 minute și stocate la –80 ° C. Alicote ale dietei individuale au fost decongelate la temperatura camerei înainte de hrănire.

Determinarea conținutului de proteine, carbohidrați, lipide și apă în dietele artificiale

Laptisorul de matca este principala sursa de proteine, dar contine si niste carbohidrati si apa. Am cuantificat cantitățile relative de proteine, carbohidrați și apă din lăptișorul de matcă comercial utilizate pentru diete pentru a ține cont de cantitatea absolută a fiecăruia dintre acești macronutrienți din cele nouă diete. De exemplu, conținutul de carbohidrați al dietei „proteine ​​medii-carbohidrați medii” include aportul de carbohidrați atât din lăptișorul de matcă, cât și din zahărul adăugat.

Conținutul de proteine ​​din lăptișorul de matcă a fost măsurat folosind un test colorimetric standard Bradford (Sigma-Aldrich, MO, SUA). Urmând protocoalele, a fost preparată o soluție de proteină albumină de 200 mg/ml și apoi s-au diluat standardele prin dizolvarea a 1, l, 2,5 pl și 5 pl din soluția de albumină în 1 ml de H2O distilat. Am diluat 1 ml de lăptișor de matcă în 10 ml de apă. Am placat 5 alicote alil din fiecare dintre cele trei standarde și am diluat lăptișorul de matcă într-o farfurie cu 96 de godeuri. Am adăugat 250 ofl de reactiv Bradford în fiecare godeu și am lăsat testul colorimetric să se dezvolte timp de 20 de minute la temperatura camerei. Am citit absorbanța probelor noastre la 595 nm folosind un spectrofotometru și am calculat conținutul de proteine ​​din lăptișor de matcă pe baza curbei noastre de absorbanță standard determinate.

Conținutul de carbohidrați și apă al jeleului a fost estimat utilizând calorimetrie de scanare diferențială (DSC) (Sopade și colab., 2004). Una până la cinci mg din proba de lăptișor de matcă a fost sigilată într-o tigaie DSC din aluminiu Perkin-Elmer. Tigaia de aluminiu a fost apoi plasată în calorimetrul de scanare diferențială (Perkin Elmer DSC Pyris 1, Waltham, MA, SUA) împreună cu o tigaie goală etanșă care a servit drept control. În timpul scanării, camera de probă a fost perfuzată cu heliu gazos la 10 ml/min. Probele au fost scanate între 25 ° C și -100 ° C la o rată de 1 ° C/min folosind un accesoriu de răcire pe bază de lichid (Perkin Elmer Cryofill ™, Waltham, MA, SUA) pentru a determina caracteristicile de îngheț și topire. Apa se topește aproape de 0 ° C, generând un vârf endotermic în scanarea calorimetrică, iar zaharurile au provocat tranziții sticloase distincte între -20 ° C și -40 ° C. Aria vârfurilor generate în timpul acestor evenimente au fost calculate și utilizate pentru a determina conținutul de apă.

Depresia punctului de îngheț a fost măsurată în lăptișorul de matcă folosind o calibrare pe bază de soluții de glucoză și fructoză în apă deionizată (5: 7%, 7: 10% și 10: 12% glucoză: fructoză). Într-un tub Eppendorf, 100 pl de lăptișor de matcă s-au diluat în 900 pl de etanol 100%, s-au vortexat timp de 1 min și s-au răcit timp de 2 ore la -80 ° C. Apoi, tuburile au fost centrifugate la 14.000 rpm (18.800 g) timp de 30 min. Supernatantul a fost îndepărtat, uscat în azot gazos curgător și reconstituit în 1 ml de apă deionizată. Cinci microlitri ai acestei soluții au fost analizați în DSC în cvintuplicate, iar punctele de îngheț și topire au fost observate și comparate cu glucoza descrisă mai sus: standarde de fructoză pentru a obține o estimare brută a conținutului de zahăr din lăptișorul de matcă.

Creșterea larvelor pe diferite tratamente dietetice

Larvele (n = 24 per dietă) au fost crescute pentru întreaga creștere a larvelor în plăci cu 48 de godeuri care au fost depozitate în interiorul camerelor modulare de incubator (Billups-Rothenberg, del Mar, CA, SUA), conținând un volum mic de 96% K2SO4 pentru a menține o umiditate ridicată. Camerele au fost menținute la o constantă de 34 ° C într-o cameră de mediu întunecată. În fiecare zi, larvele au fost îndepărtate din camera de mediu și s-a adăugat un volum suplimentar specific de zi de dietă artificială în fiecare godeu după cum urmează: zilele 1 și 2, 10 pl; ziua 3, 20 pl; ziua 4, 30 pl; ziua 5, 40 pl; și ziua 6, 50 iul. Fiecare larvă a fost aprovizionată cu un total de 160 pl de dietă artificială. Larvele au fost păstrate în aceste condiții până când au terminat complet consumarea proviziilor, moment în care au fost scoase din plăcile puțului și mutate pe plăcile de pupație sau declarate moarte și eliminate din studiu. Moartea a fost indicată de zile repetate de imobilitate, lipsă de creștere și aspect înnegrit.

Analiza datelor și prezentarea datelor

Analizele statistice au fost efectuate folosind versiunea R 3.1.3 (R Core Team). Utilizarea pachetelor R suplimentare este raportată mai jos, acolo unde este cazul.

Supravieţuire

Supraviețuirea larvelor a fost monitorizată zilnic până la moartea sau atingerea stadiului prepupal. Din aceasta, am calculat proporția persoanelor care au supraviețuit pentru fiecare tratament și am comparat supraviețuirea între diferite tratamente dietetice folosind testul proporțional în perechi. Am analizat efectele conținutului de proteine ​​și carbohidrați (%) asupra supraviețuirii folosind un model liniar generalizat cu o funcție de legătură „probit”. Variabila de răspuns a fost supraviețuirea, scorată ca binomial (1,0), iar conținutul de proteine ​​și carbohidrați calculat (%) au fost variabilele explicative (vezi Tabelul 1). Așa cum este standard pentru analiza geometrică a nutriției (Le Gall și Behmer, 2014; Lee, 2007; Lee și colab., 2008), acest model a inclus termeni pătratici pentru proteine ​​și carbohidrați, precum și un termen de interacțiune între proteine ​​și carbohidrați. Am analizat apoi efectele termenilor modelului asupra supraviețuirii folosind analiza testelor de devianță și de probabilitate. Testele de grup post-hoc dintre grupuri de tratament au fost efectuate utilizând comparația perechi a proporțiilor.

Rata de crestere

Timp de dezvoltare

Pentru toți indivizii supraviețuitori din studiul nostru, am calculat timpul de dezvoltare (TD) ca timpul la care au atins stadiul prepupal după consumarea tuturor resurselor larvare furnizate. Analiza preliminară a datelor a arătat că timpii de dezvoltare au avut o distribuție puternică la coadă dreaptă și, în plus, dimensiunile eșantionului au variat semnificativ între tratamente din cauza diferențelor de mortalitate. Datorită acestor considerații statistice, TD a fost modelat ca un răspuns al conținutului de proteine ​​și carbohidrați utilizând un model liniar generalizat cu o funcție de legătură Poisson, deoarece timpul de dezvoltare reprezintă un număr de zile pentru creșterea larvelor. Am inclus conținutul de proteine ​​(%), conținutul de carbohidrați (%), termenii pătratici atât pentru conținutul de proteine, cât și pentru carbohidrați și o interacțiune între conținutul de proteine ​​și carbohidrați ca variabile explicative în modelul nostru. Apoi am evaluat termenii modelului folosind analiza testelor de devianță și de probabilitate.

Peisaje performante

Pentru a determina modul în care dezvoltarea larvelor albinelor este afectată de nivelurile variate de macronutrienți din prevederi, a fost implementată o „metodologie de răspuns-suprafață” (Le Gall și Behmer, 2014; Lee și colab., 2008) pentru a vizualiza modul în care supraviețuirea, rata de creștere, și schimbarea timpului de dezvoltare cu cantități și raporturi variate de proteine ​​și carbohidrați. Supraviețuirea, rata de creștere și ratele de dezvoltare au fost mapate pe peisajele de performanță proteine-carbohidrați (Le Gall și Behmer, 2014; Lee și colab., 2008). Acest lucru a fost realizat prin montarea unei suprafețe de spline subțiri pe date, folosind pachetul „câmpuri” pentru R (Nychka și colab., 2015).

Mulțumiri

Dorim să mulțumim lui A. Bennett, E. Welker, R. Ruud și M. Larson pentru asistența acordată în menținerea coloniilor de albine și implementarea inițială a creșterii in vitro. W. Kemp și J. Rinehart au oferit feedback și sugestii cruciale pentru metode și dezvoltarea ideilor. Acest manuscris a fost îmbunătățit semnificativ de criticile și comentariile a doi recenzori anonimi.

Note de subsol

Interese concurente

Autorii nu declară interese concurente sau financiare.

Contribuțiile autorului

Conceptualizare: B.R.H.; Metodologie: B.R.H., G.P.S., A.R.; Software: B.R.H.; Validare: G.P.S.; Analiză formală: B.R.H., A.R.; Investigație: B.R.H., G.P.S., A.R.; Resurse: B.R.H., G.D.Y., J.H.B.; Scriere - proiect original: B.R.H., G.P.S., A.R., G.D.Y., K.J.G., J.H.B.; Scriere - recenzie și editare: B.R.H., G.P.S., A.R., G.D.Y., K.J.G., J.H.B.; Vizualizare: B.R.H.; Supraveghere: B.R.H., A.R., G.D.Y., K.J.G., J.H.B.; Administrarea proiectului: G.D.Y., K.J.G., J.H.B.; Achiziție de finanțare: B.R.H., G.D.Y., K.J.G., J.H.B.

Finanțarea

Această lucrare a fost susținută de Departamentul SUA pentru Agricultură-Serviciul de Cercetări Agricole (USDA-ARS) în genetică și biochimie a insectelor, Universitatea de Stat din Dakota de Nord Departamentul de Științe Biologice din Fargo, ND, National Science Foundation-Integrative Organismal Systems (NSF IOS) 0953297 la KJG și NSF IOS 1557940 la JHB.

Disponibilitatea datelor

Date disponibile gratuit de la autori la cerere și depuse în Dryad sub doi: 10.5061/dryad.11765, titlul „Date from: The geometric framework for nutrition rivelează interacțiunile dintre proteine ​​și carbohidrați în timpul creșterii larvelor la albinele de miere”.