Jiajia Chen

1 Departamentul de Neurobiologie, Colegiul de Medicină de Bază, China Medical University, Shenyang, China

autofagie

2 Institutul de patologie și fiziopatologie, China Medical University, Shenyang, China

Libo Liu

1 Departamentul de Neurobiologie, Colegiul de Medicină de Bază, China Medical University, Shenyang, China

2 Institutul de Patologie și Fiziopatologie, Universitatea de Medicină din China, Shenyang, China

Yunhui Liu

3 Departamentul de Neurochirurgie, Spitalul Shengjing al Universității Medicale din China, Shenyang, China

4 Centrul de cercetare Liaoning pentru medicina translațională în bolile sistemului nervos, Shenyang, China

Xiaobai Liu

3 Departamentul de Neurochirurgie, Spitalul Shengjing al Universității Medicale din China, Shenyang, China

4 Centrul de cercetare Liaoning pentru medicina translațională în bolile sistemului nervos, Shenyang, China

Chengbin Qu

3 Departamentul de Neurochirurgie, Spitalul Shengjing al Universității Medicale din China, Shenyang, China

4 Centrul de cercetare Liaoning pentru medicina translațională în bolile sistemului nervos, Shenyang, China

Fanjie Meng

1 Departamentul de Neurobiologie, Colegiul de Medicină de Bază, China Medical University, Shenyang, China

2 Institutul de Patologie și Fiziopatologie, Universitatea de Medicină din China, Shenyang, China

Iun Ma

1 Departamentul de Neurobiologie, Colegiul de Medicină de Bază, China Medical University, Shenyang, China

2 Institutul de Patologie și Fiziopatologie, Universitatea de Medicină din China, Shenyang, China

Yang Lin

1 Departamentul de Neurobiologie, Colegiul de Medicină de Bază, China Medical University, Shenyang, China

2 Institutul de Patologie și Fiziopatologie, Universitatea de Medicină din China, Shenyang, China

Yixue Xue

1 Departamentul de Neurobiologie, Colegiul de Medicină de Bază, China Medical University, Shenyang, China

2 Institutul de Patologie și Fiziopatologie, Universitatea de Medicină din China, Shenyang, China

Abstract

Introducere

Gliomul este considerat ca fiind cel mai răspândit neoplasm intracranian malign primar. Glioblastomul este tipul de gliom care reprezintă 50-60% din tumorile maligne ale creierului (Jakab și colab., 2011). Glioblastomul a fost definit ca o tumoare malignă de gradul III-IV de către Organizația Mondială a Sănătății datorită gradului său ridicat de malignitate și mitozei active. Tratamentele existente pentru glioblastom includ intervenții chirurgicale, radioterapie postoperatorie, chimioterapie și alte terapii adjuvante; cu toate acestea, eficacitatea tratamentului este slabă datorită malignității sale ridicate, invazivității puternice și rezistenței la radioterapie și chimioterapie (McLendon și Halperin, 2003; Wen și Kesari, 2008; Bartek și colab., 2012). Prin urmare, o strategie nouă este urgent necesară pentru tratamentul cu glioblastom.

Polipeptida-II care activează endoteliul-monocit (EMAP-II), o polipeptidă multifuncțională, are activități pro-inflamatorii și antiangiogene (Mogylnytska, 2015). EMAP-II a fost aplicat pe scară largă ca tratament deoarece inhibă creșterea, proliferarea și metastaza tumorilor primare și metastatice (Schwarz și colab., 1999). EMAP-II inhibă în mod semnificativ activitatea celulelor adenocarcinomului ductal pancreatic (Schwarz și colab., 2010) și exercită efecte anticanceroase la xenogrefele adenocarcinomului de prostată (Reznikov și colab., 2007). Studiile noastre preliminare au demonstrat că tratamentul cu doze mici EMAP-II poate crește permeabilitatea barierei hemato-tumorale (BTB; Xie și colab., 2010). Aceste rezultate indică faptul că efectele antitumorale ale EMAP-II sunt mediate prin deschiderea BTB, care permite penetrarea medicamentelor anticanceroase. Descoperirile noastre anterioare au arătat că EMAP-II cu doze mici (0,05 nM) induce direct apoptoza celulelor de gliom C6 de șobolan prin calea mitocondrială (Liu și colab., 2015b); EMAP-II induce autofagia celulelor de gliom U-118 pe lângă inhibarea activității acestora (Liu și colab., 2013). Acest lucru demonstrează că EMAP-II suprimă viabilitatea celulelor gliomului prin apoptoză sau autofagie, ceea ce duce la un efect antitumoral.

Autofagia este un proces conservat din punct de vedere evolutiv, care este adesea activat sub stres celular (Kroemer și colab., 2010). Autofagia poate proteja celulele de daune, dar poate induce și moartea celulelor (Shen și Codogno, 2011). Studiile au observat din ce în ce mai mult moartea celulelor tumorale din cauza autofagiei (Akar și colab., 2008; Seong și colab., 2014). Temozolomida, un medicament sensibil pentru tratamentul gliomului, provoacă oprirea fazei G2/M în celulele gliomului și induce moartea celulelor autofagice în locul apoptozei (Kanzawa și colab., 2003, 2004). Speculăm că glioblastomul malign este mai sensibil la căile de moarte a celulelor autofagice (Lefranc și colab., 2005, 2006) și că EMAP-II poate induce moartea celulelor gliomice prin autofagie, dar mecanismul molecular rămâne neclar.

MicroARN este foarte implicat în reglarea diferitelor răspunsuri fiziologice și patologice în celule (Bartel, 2004, 2009; Ebert și Sharp, 2012) și poate modula, de asemenea, rețelele de semnalizare autofagică, în special în cancer (Frankel și colab., 2011; Fu și colab., 2012; Korkmaz și colab., 2012). MicroRNA-20a (MiR-20a), un membru al familiei miR-17-92 situat pe cromozomul 13, este extrem de exprimat în țesuturile de gliom; supraexprimarea miR-20a favorizează proliferarea celulelor de gliom U-251, sugerând un efect de promovare a tumorii (Yao și colab., 2012). Mai mult, miR-20a este, de asemenea, considerat ca o genă legată de autofagie (ATG) și poate participa la reglarea autofagiei induse de lipsa de leucină prin modificarea nivelurilor intracelulare ale proteinelor cheie legate de autofagie în mioblastele C2C12 (Wu și colab., 2012). Aceste constatări sugerează că expresia scăzută a miR-20a contribuie la reglarea în sus a expresiei proteinelor legate de autofagie, activează autofagia și inhibă proliferarea celulelor gliomice. Nu se știe dacă EMAP-II induce autofagie prin reglarea descendentă a expresiei miR-20a și, astfel, afectează viabilitatea celulelor gliomice.

Acest studiu își propune să verifice dacă tratamentul EMAP-II cu doze mici (0,05 nM) induce autofagia în celulele de gliom U-87 și U-251 prin reglarea expresiei miR-20a și explorează mecanismele moleculare asociate cu EMAP-II- autofagia celulelor gliomice induse.

Materiale și metode

Linii celulare și culturi celulare

Linia celulară de gliom malign uman U-87, U-251 și linia celulară HEK293T de rinichi embrionar uman au fost achiziționate de la Shanghai Institutes for Biological Sciences and Cell Resource Center (MD, SUA). Celulele U-87 și HEK293T au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS, Life Technologies Corporation, Paisley, Marea Britanie). Celulele U-251 au fost cultivate în DMEM/F12 suplimentat cu 10% FBS. Toate celulele au fost cultivate la 37 ° C într-o atmosferă de 5% CO2 și 95% aer.

Grupuri experimentale

Pentru a testa efectul EMAP-II asupra celulelor U-87 și U-251, experimentele au fost împărțite în cinci grupuri (n = 8): (1) Grup de control, celulele au fost tratate cu 0,9% clorură de sodiu (NS); (2) Grupul EMAP-II 0,5 h, celulele au fost tratate cu EMAP-II timp de 0,5 h; (3) Grupul EMAP-II 1 h, celulele au fost tratate cu EMAP-II timp de 1 h; (4) Grupul EMAP-II 3 h, celulele au fost tratate cu EMAP-II timp de 3 h; și (5) grupul EMAP-II 6 h, celulele au fost tratate cu EMAP-II timp de 6 h. EMAP-II (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost dizolvat în 0,9% clorură de sodiu și 0,05 nM a fost selectat ca concentrație optimă pentru investigația noastră conform cercetărilor noastre anterioare (Liu și colab., 2013).

Pentru a investiga dacă autofagia sau apoptoza a fost implicată în procesul de reglare a celulelor gliomice EMAP-II, inhibitorul autofagiei 3-metiladenină (3-MA; Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, SUA) sau inhibitorul apoptozei Z-VAD-FMK (Z-VAD; Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, SUA) au fost administrate înainte de EMAP-II. 3-MA (2 mM) și Z-VAD (100 μm) au fost administrați cu 1 oră înainte de administrarea EMAP-II. Celulele au fost împărțite în opt grupuri (n = 8): (1) Grup martor, celulele au fost tratate cu 0,9% clorură de sodiu; (2) Grupul EMAP-II, celulele au fost tratate cu EMAP-II timp de 0,5 ore; (3) Grupa 3-MA, celulele au fost tratate cu 3-MA timp de 1 oră; (4) Grupul EMAP-II + 3-MA; (5) Grupul Z-VAD, celulele au fost tratate cu Z-VAD timp de 1 oră; (6) Grupul EMAP-II + Z-VAD; (7) grupul 3-MA + Z-VAD; (8) Grupul EMAP-II + 3-MA + Z-VAD.

Pentru a studia efectul miR-20a asupra EMAP-II care induce autofagia celulelor de gliom U-87 și U-251, experimentele au fost împărțite în 10 grupuri (n = 8): (1) Grup de control; (2) grupul EMAP-II; (3) grup miR-20a (+) NC, transfectat cu control negativ al supraexprimării miR-20a; (4) grup miR-20a (+), transfectat cu supraexpresie miR-20a; (5) miR-20a (-) grup NC, transfectat cu control negativ al reducerii miR-20a; (6) grup miR-20a (-), transfectat cu silențiere miR-20a; (7) EMAP-II + miR-20a (+) grup NC; (8) grupul EMAP-II + miR-20a (+); (9) EMAP-II + miR-20a (-) grup NC; și (10) grupul EMAP-II + miR-20a (-).

Pentru a verifica în continuare efectul de reglare al miR-20a asupra expresiei ATG7 și ATG5, experimentele au fost împărțite în cinci grupe: (1) Grup de control; (2) miR-20a (+) grup NC; (3) grupul miR-20a (+); (4) miR-20a (-) grup NC; și (5) grupul miR-20a (-).

Pentru a studia efectul inhibitorului EMAP-II și miR-20a singur și în combinație asupra proliferării celulare, migrației și invaziei, celulele U-87 și U-251 au fost împărțite în șase grupuri (n = 8): (1) Grup de control; (2) grupul EMAP-II; (3) miR-20a (-) grup NC; (4) grupul miR-20a (-); (5) NS + miR-20a (-) grup NC, tratament cu 0,9% clorură de sodiu după control negativ al miR-20a mutarea transfecției; și (6) grupul EMAP-II + miR-20a (-).

Transfecția celulară

Celulele au fost însămânțate pe plăci cu șase godeuri cultivate peste noapte, apoi transfectate cu miR-20a mimic, inhibitor miR-20a sau controlul lor negativ (GenePharma, Shanghai, China) folosind reactivul lipofectamină 2000 (Life Technologies Corporation) conform instrucțiunilor producătorului . După 6 ore de transfecție, mediul a fost îndepărtat și înlocuit cu mediu proaspăt. Celulele au fost recoltate după 48 de ore. După ce s-au stabilit clonele celulare ale supraexprimării sau mutării miR-20a, EMAP-II a fost administrat timp de 0,5 ore.

Analiza viabilității celulare

Viabilitatea celulară a fost analizată prin testul MTT (Solarbio Company, Beijing, China). Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 5 × 103 celule/godeu. Celulele au fost incubate peste noapte și apoi tratate cu EMAP-II (0,05 nM) timp de 0,5, 1, 3 și 6 ore, în timp ce tratamentele cu 0,9% clorură de sodiu ca martor. Apoi, mediul a fost înlocuit cu mediu proaspăt și celulele au fost cultivate la 37 ° C timp de 24 de ore. După aceea, s-a adăugat 5 mg/ml mediu MTT la fiecare godeu și s-a incubat încă 4 ore. Apoi, mediile au fost îndepărtate cu atenție și cristalele de formazan au fost solubilizate cu 150 μL DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Ulterior, valorile densității optice (OD) au fost determinate prin spectrofotometrie la 570 nm.

Testul de migrare și invazie celulară

Abilitățile de migrație și invazie celulară au fost evaluate de o cameră transwell cu 24 de godeuri cu dimensiunea porilor de 8 um (Costar, SUA). Celulele au fost suspendate în 100 μL mediu seric și apoi au fost adăugate în camera superioară (fără test Matrigel pentru migrarea celulei) sau însămânțate pe camerele superioare pre-acoperite cu Matrigel (pentru testul invaziei celulare), în timp ce 500 μL mediu cu 10% FBS a fost adăugat la camera inferioară. EMAP-II (0,05 nM) a fost adăugat la camera inferioară timp de 0,5, 1, 3 și 6 ore. Apoi, mediul din camera inferioară a fost înlocuit cu mediu proaspăt. După incubare timp de 24 de ore, celulele migrate sau invadate către fundul membranei au fost fixate și apoi colorate cu 20% Giemsa. Camerele au fost supuse unei inspecții microscopice și numărate.

Analiza Western Blot

Concentrația de proteine ​​a celulelor de gliom U-87 și U-251 a fost determinată prin testul proteinei BCA (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China). Proteinele (20-40 μg) au fost separate de 10-12% SDS-PAGE și transferate pe membrane de nitroceluloză. Membranele au fost blocate cu lapte degresat 5% timp de 2 ore și apoi incubate peste noapte cu anticorpi primari împotriva proteinei asociate cu microtubuli un lanț ușor 3 (LC3, 1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, SUA, ab63817), ATG7 1: 1000, Abgent, San Diego, CA, SUA, AP1813c), ATG5 (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, SUA, 10181-2-AP), P62/SQSTM1 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, SUA, ab56416), GAPDH (1: 10.000, Proteintech, Chicago, IL, SUA, 6000-4-Ig), respectiv. După spălare cu TBST, membranele au fost apoi incubate cu anticorpi secundari. Benzile de proteine ​​au fost vizualizate cu un kit de chemiluminiscență îmbunătățit (ECL) (Santa Cruz Biotechnology) și scanate cu software-ul Chemi Imager 5500 V2.03.

Extracția ARN și RT-PCR cantitativă

ARN-ul total a fost izolat folosind reactivul Trizol (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Analiza PCR în timp real a fost efectuată pentru a testa nivelurile de expresie ale miR-20a, ATG7 și ATG5 prin intermediul unui sistem rapid PCR în timp real 7500. Pentru cuantificarea expresiei miR-20a, transcrierea inversă și amplificarea PCR în timp real au fost efectuate folosind Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit și Taqman Universal Master Mix II cu TaqMan MicroRNA Assay de miR-20a și U6 (Applied Biosystems, Foster, CA, SUA), respectiv. Pentru cuantificarea ARNm ATG7 și ATG5, transcrierea inversă și amplificarea PCR în timp real au fost efectuate folosind kitul RT-PCR și SYBR Premix Dimer Eraser (TaKaRa, Dalian, China) cu testele de expresie genică ale ATG7, ATG5 și GAPDH (Applied Biosystems ), respectiv. Modificările de pliuri au fost calculate prin metoda cuantificării relative (2 - △△ Ct).

Colorarea imunofluorescentă

Celulele au fost însămânțate pe lamele de acoperire în plăcile cu șase godeuri și incubate timp de 24 de ore. Celulele au fost colorate cu LysoTracker Red la o concentrație finală de 50 nM. Apoi, celulele au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 20 de minute, blocate cu 5% BSA timp de 2 ore și incubate cu anticorpul primar pentru LC3 (1: 150, Abcam, Cambridge, MA, SUA, ab63817) sau P62/SQSTM1 ( 1: 500, Abcam, Cambridge, MA, SUA, ab56416) la 4 ° C peste noapte. După aceea, celulele au fost spălate și incubate cu un anticorp secundar conjugat cu Alexa Fluor 488 și Alexa Fluor 555 (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China). Celulele au fost apoi colorate cu DAPI (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China) timp de 10 minute și vizualizate cu un microscop confocal.

Reporter Vectors Constructs și Luciferase Assays

Situsul de legare putativ între 3'UTR de ATG7 (ATG5) mARN și regiunea de semințe a miR-20a au fost prezise de către TargetScan Human Release 6.2. Celulele HEK293 au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri și cultivate peste noapte la 37 ° C. După aceea, celulele au fost co-transfectate cu plasmida reporter ATG7 (ATG5) -3'UTR de tip sălbatic sau mutant (GenePharma, Shanghai, China) și transfectate cu miR-20a mimic sau miR-20a mimic NC. Testele de luciferază au fost efectuate 48 de ore mai târziu folosind sistemul de testare a reporterului dual-luciferază (Promega, Beijing, China).

Implantarea de xenogrefă tumorală la șoareci nud

Celulele U-87 și U-251 transfectate stabil au fost utilizate în studiul in vivo. Lentivirusul care codifică silențiere miR-20a a fost generat folosind pLenti6.3/V5eDEST Gateway Vect - sau Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, SUA). Tăierea miR-20a a fost ligată în vectorul pLenti6.3/V5eDEST (GenePharma, Shanghai, China) și apoi a fost generat vectorul pLenti6.3/V5eDEST-miR-20a-scilecing. Lentivirusul a fost generat în celule 293FT folosind amestecul de ambalare ViraPower. După infecție, celulele stabile care exprimă miR-20a-tacere [miR-20a (-)] au fost culese.

Analize statistice

Datele au fost prezentate ca medie ± deviație standard (SD) și efectuate cu SPSS 13.0 (SPSS, IL, SUA). Analiza statistică a fost efectuată folosind testul t al elevului și ANOVA cu sens unic. P 1A, B, viabilitatea celulară a celulelor U-87 și U-251 a fost inhibată de EMAP-II într-o manieră dependentă de timp. Efectul de inhibare asupra viabilității celulare a fost cel mai semnificativ după ce celulele au fost tratate cu EMAP-II timp de 0,5 ore în comparație cu grupul de control respectiv (P 1E - J).