Abstract

Introducere

S-a raportat în mod repetat că dietele ketogenice cu restricție de carbohidrați, îmbogățite în grăsimi în detrimentul glucidelor, suprimă cancerul de sân (15, 16). Suprimarea tumorilor de către dietele ketogenice a fost atribuită limitării insulinei și IGF1 care acționează ca factori de creștere (revizuite în ref. 17) și cerinței obligatorii a celulelor maligne pentru metaboliții derivați din glucoză (de exemplu, nucleotide, NADPH) pentru aprovizionarea cu cerințele lor de biomasă. (Efectul Warburg, revizuit în ref. 18). Într-adevăr, cancerul de sân este promovat de rezistența la insulină/hiperinsulinemie, iar sensibilizatorii la insulină utilizați pentru tratarea diabetului de tip 2 (de exemplu, metformina) par a fi eficienți în suprimarea tumorigenezei în general și a cancerului de sân în special (19). Alternativ, eficacitatea dietelor ketogenice în suprimarea tumorigenezei poate fi atribuită în continuare eficacității inerente a acizilor grași cu lanț lung liber/neesterificat (LCFA), dacă li se permite să atingă concentrații intracelulare suficient de mari. Restricția carbohidraților poate permite într-adevăr acest lucru, limitând disponibilitatea glicerol-3-fosfatului și insulinei necesare pentru esterificarea LCFA în produse lipidice din aval (20).

acizilor

Eficacitatea inerentă presupusă a LCFA neesterificată pentru a suprima transformarea poate fi simulată de analogii MEDICA. Analogii MEDICA (21) constau din acizi dioici cu lanț lung, α, ω - HOOC - C (α ′) - C (β ′) - Q - C (β) –C (α) –COOH, unde Q reprezintă un element miez cu lanț lung], substituit în αα ′ (Mαα), ββ ′ (Mββ) și/sau alți atomi de carbon opționali. Analogii MEDICA pot fi tioesterificați la co-tioesterii lor respectivi, dar aceștia nu sunt esterificați în lipide și nici transformați în ceramide, în timp ce substituțiile în pozițiile αα 'sau ββ' le blochează β-oxidarea. Analogii MEDICA sunt excretați în cea mai mare parte în bilă ca glucuronide respective. Ca atare, analogii MEDICA pot imita activitățile alosterice ale LCFA libere/neesterificate, evitând în același timp rolul lor de substraturi pentru β-oxidare sau esterificare în lipide. Mai mult, analogii MEDICA s-au dovedit a fi eficienți hipolipidemici antidiabetici într-o serie de modele animale diabetice obeze (22-24, 26), determinându-ne interesul de a studia eficacitatea dietei ketogene și MEDICA în contextul cancerului de sân.

Materiale și metode

Animale și diete

Imunohistochimie

Probele de tumoră mamară fixate în 4% formaldehidă tamponată au fost încorporate în parafină. Secțiunile (5 μm) au fost deparafuite și rehidratate prin diluții gradate de etanol, urmate de fierbere în tampon citrat de 25 mmol/L, pH 7,4, la 115 ° C timp de 3 minute. Activitatea endogenă a peroxidazei a fost blocată cu 3% peroxid de hidrogen. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpii primari, după cum s-a indicat, urmată de incubarea cu peroxidază de hrean (HRP) sau anticorpi secundari fluorescenți conjugați (laboratorul Jackson). Secțiunile incubate cu HRP au fost contracolorate cu hematoxilină. Intensitatea fluorescentă a fost analizată prin microscopie confocală utilizând DAPI pentru vizualizarea nucleelor ​​(Zeiss LSM 710; Axio observator Z1). Plămânii au fost excizați și fixați în formalină peste noapte și apoi încorporați în parafină. Secțiunile (5 μm) au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și analizate cu ajutorul microscopiei computerizate (Ariol SL-50; Olympus BX61 Imaging Applied).

Culturi celulare

Celulele primare MMTV-PyMT au fost izolate de la șoareci MMTV-PyMT de 16 săptămâni, așa cum s-a descris anterior (25). Celulele Met-1 (Dr. Alexander Borowsky, Centrul de Medicină Comparată, Universitatea din California, Davis, Davis, CA) și celulele primare au fost cultivate în DMEM complet (Biologic Industries) suplimentat cu soluție de penicilină - streptomicină, l-glutamină și 10 % FCS, urmat de adăugarea MEDICA așa cum este indicat. Proliferarea celulară a fost cuantificată utilizând testul de albastru de metilen. Celulele Met-1 cultivate în 24 de plăci au fost transfectate cu plasmidă reporter M67-TATA-TK-LUC (1 μg), plasmide de expresie pentru STAT3 constitutiv (0,1 μg) și pentru CMV - β-galactozidază (0,1 μg), folosind ADN jetPEI reactiv de transfecție (26). După 8 ore, mediul a fost schimbat și celulele au fost tratate timp de 24 de ore cu MEDICA așa cum s-a indicat. Activitatea luciferazei normalizată la β-galactozidază a fost măsurată așa cum s-a descris anterior (26). Celulele HCC1954 (ATCC CRL-2338) au fost cultivate în RPMI-1640 (Biological Industries) suplimentate cu soluție de penicilină - streptomicină și 10% FCS și s-au adăugat MEDICA așa cum este indicat. Unde este indicat, celulele HCC1954 au fost infectate cu constructe knockout lentivirus din sh-c-Src, sh-STAT3 sau plasmide scramble (misiunea Sigma), urmate de selecția puromicinei.

Test clonogen

Celulele respectivelor plăci experimentale au fost tripsinizate. Un total de 7.500 de celule au fost placate pe o placă de 60 mm și lăsate să formeze colonii timp de 10 zile. Celulele au fost fixate cu gluteraldehidă 0,625% și colorate cu albastru de metilen. Au fost numărate coloniile care depășeau dimensiunea de 400 μm.

Liza celulară și Western blot

Celulele cultivate au fost răzuite cu 1 X tampon de liză (50 mmol/L Tris HCI pH 8,0, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EGTA, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L NaPPi, 50 mmol/L NaF, 1 mmol/L PMSF, 1 mmol/L Na Vanadat, 40 nmol/L bpVfan și cocktail inhibitor de protează (Sigma) și centrifugat timp de 15 minute la 12.500 rpm Probele de tumori congelate au fost omogenizate în tampon de liză folosind omogenizatorul Polytron Concentrația de proteine ​​a fost determinată de BCA (Thermo Scientific) Cu excepția cazului în care se indică altfel, lizatele de proteine ​​au fost preparate în tampon de probă SDS [62 mmol/L Tris (pH 6,8), 2,3% SDS, 0,64 mmol/L mercaptoetanol, 10% glicerol], supuse SDS-PAGE, electrotransferat pe membrane de azotat de celuloză (Schleicher & Schuell) și sondat cu primul anticorp indicat, urmat de al doilea anticorp marcat HRP. Unde este indicat, lizații de proteine ​​au fost preparați în tampon de probă SDS lipsit de mercaptoetanol. De ECL și intensitatea a benzilor individuale a fost determinată prin densitometrie folosind Software-ul TINA 2.10.

Imunoprecipitare

Celulele MET-1 au fost incubate după cum s-a indicat. După incubare, celulele au fost clătite o dată în PBS rece și lizate cu 50 mmol/L Hepes (pH 7,4), 150 mmol/L NaCl, 10% glicerol, 1,5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EGTA, 1% Triton, 50 mmol/L β-glicerolfosfat, 25 mmol/L NaF, 1 mmol/L Na-vanadat, 40 nmol/L bpVfen, amestec inhibitor de protează (Sigma) și 17,5 mg/ml Octil beta-D-glucopiranozid (Sigma). Lizatele au fost ținute pe gheață timp de 30 de minute și centrifugate la 12.000 rpm timp de 15 minute. Lizat de 250 μg a fost incubat timp de 4 ore cu mărgele de proteină A/G (Santa Cruz Biotechnology) preîncărcate cu anticorpul indicat. Imunoprecipitatul a fost clătit de trei ori cu tampon de spălare [20 mmol/L Hepes (pH 7,4), 150 mmol/L NaCI, 0,1% Tx-100, 10% glicerol], suspendat în tampon de probă SDS și fiert timp de 8 minute. Proteinele imunoprecipitate au fost analizate prin SDS-PAGE/Western blot.

qRT-PCR

ARN-ul a fost purificat din țesuturile înghețate ale șoarecilor folosind Mini Kit-ul Total ARN (Geneaid). ARN de 0,5 μg a fost utilizat ca șablon pentru sinteza ADNc folosind transcriptaza inversă M-MLV (Invitrogen). S-a efectuat PCR în timp real (Rotorgene, Corbett Research) folosind KAPA SYBR FAST qPCR MIX (Kapa Biosystems) cu următorii primeri (5 ′ până la 3 ′): MMP9 (Fw: AACCTCCAACCTCACGGACAC, Rev: CTGCT-TCTCTCCCATCATCTGG); E-cadherină (Fw: TCATCATTGAGAGGGAGACAGGCT, Rev: TGGGTAAACTCTGGCCTGTTGTCA); Ezh2 (Fw: GACGATGATGGAGATGA-TCCAGATG, Rev: CCGAG-GTGGGCAAGTTTCTTTATC); PyMT (Fw: CTCCAACAGATCACCCGCACATACT, Rev: GCTGGTCTTGGTCGCTTTCTGGA-TAC). ARNm a fost cuantificat utilizând metoda ΔΔCt (27).

ELISA

Conținutul VEGF al lizatelor de șoarece a fost determinat folosind kitul Quantikine Mouse VEGF (sistem R&D) conform instrucțiunilor producătorului.

Producția ROS

Producția de specii reactive de oxigen (ROS) a fost determinată de 2,7 diclorofluorescein diacetat (DCF; 5 μmol/L) adăugat la culturile celulare respective în ultimele 15 minute de incubație. Celulele au fost spălate o dată cu PBS și lizate cu 0,5% TX-100. Fluorescența DCF a fost determinată prin analiza de excitație/emisie 485/530 nm. Producția de peroxid de hidrogen a fost determinată prin incubarea mediilor de creștere respective (fără fenol roșu) cu HRP/Amplex Red (Invitrogen). Fluorescența a fost determinată prin analiza de excitație/emisie de 560/590-nm. Raportul glutation/disulfură de glutation (GSH/GSSG) a fost determinat de testul GSH/GSSG-Glo (Promega) conform protocolului producătorului.

Anticorpi

Anticorpii anti - β-cazeină, anti-Erk și anti-fosfo-Erk (Tyr204) provin de la Santa Cruz Biotechnology; anti-pHH3, anti-Akt, anti-phospho-Akt (Ser473), anti-phospho-c-Src (Tyr416), anti-phospho-c-Src (Tyr527), anti-clivat caspase-3, anti-phospho- Anticorpii FAK (Tyr925), anti-fosfo-p130CAS (Tyr910) proveneau de la Cell Signaling Technology; anticorpii anti-c-Src și anti-Ezh2 provin de la Millipore; anticorpul anti-BrdUrd a fost de la Thermo Scientific; anticorpul anti-CD34 a fost de la Cedarlane; anticorpii anti-E-caderină, anti-β-catenină, anti-p130CAS și anti-FAK proveneau de la BD Transduction Laboratories; anticorpul antitubulinic a fost de la Sigma. Inhibitorii c-Src kinazei provin din LC Laboratories.

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată prin măsură repetată homoscedastică cu două cozi ANOVA. Semnificația a fost analizată prin testul t asociat.

Rezultate

Suprimarea creșterii tumorale MMTV-PyMT prin restricție de carbohidrați

Suprimarea tumorigenezei MMTV-PyMT prin dieta ketogenică a fost verificată la șoarecii transgenici MMV-PyMT șoareci hrăniți pe parcursul săptămânilor 4 până la 12 cu o dietă standard, bogată în grăsimi sau cetogenă, constând din raporturi de energie carbohidrați/grăsimi 3,2, 0,4 și 0,004 respectiv. Masa tumorală a scăzut cu 65% la creșterea energiei grase din dietă în detrimentul carbohidraților din dietă (Fig. 1A), cu creșterea latenței tumorale (nu este prezentată). Suprimarea masei tumorale prin dieta ketogenică a fost însoțită de scăderea colorării BrdUrd (Fig. 1B). Gradul de scădere a masei tumorale prin dieta ketogenică a fost în esență similară cu cea a MEDICA dozată cu dieta standard bogată în carbohidrați (Fig. 1A).

Discuţie

Șaptezeci la sută din cancerele de sân uman exprimă c-Src activ, în timp ce 50% exprimă STAT3 constitutiv (12, 13). Mai mult, c-Src este raportat a fi un factor oncogen comun al căilor variabile de rezistență la trastuzumab, ceea ce implică faptul că suprimarea activității sale poate depăși rezistența (40). În mod similar, STAT3 joacă un rol esențial în celulele stem ale cancerului de sân, fiind corelat cu rezistența la tamoxifen (41). Prin urmare, strategiile de tratament pentru suprimarea interacțiunii c-Src/STAT3 sunt relevante în tratarea cancerului de sân uman (14).

c-Src joacă un rol obligatoriu în inducerea cancerului de sân la șoarecii transgenici MMTV-PyMT, în care fosforilarea membrană PyMT prin c-Src are ca rezultat proliferarea și supraviețuirea celulelor (42). Prin urmare, complexul c-Src/PyMT poate fi vizualizat ca RTK uman oncogen, cu c-Src acționând ca tirosin kinază obligatorie. Concomitent, supraviețuirea celulelor PyMT este promovată de STAT3 constitutiv (5). În mod similar cu modelul MMTV-PyMT, supraviețuirea celulelor canceroase de sân HCC1954 umane este prezentată aici ca fiind condusă de ambele, c-Src și STAT3. De remarcat, driverele oncogene c-Src și STAT3 sunt prezentate aici pentru a acționa independent în promovarea MMTV-PyMT, precum și a supraviețuirii celulelor HCC1954, subliniind necesitatea abrogării ambelor pentru suprimarea cancerului de sân.

Suprimarea supraviețuirii celulelor MMTV-PyMT și HCC1954 de către MEDICA este prezentată aici ca fiind parțial explicată prin suprimarea căii de transducție STAT3, în conformitate cu rapoartele noastre anterioare în alte tipuri de celule (26). Suprimarea STAT3 în celulele MMTV-PyMT și HCC1954 de către MEDICA este reflectată de o scădere a fosfo-STAT3 (Tyr705) și a activității transcripționale STAT3. Suprimarea supraviețuirii celulare de către MEDICA se datorează în continuare producției de ROS indusă de MEDICA, rezultând c-Src inactiv care nu reușește să activeze substraturile sale din aval (35, 38). Astfel, tratamentul MEDICA este prezentat aici pentru a abroga asocierea c-Src cu schela sa PyMT, precum și pentru a suprima fosforilarea substraturilor aval c-Src, cum ar fi FAK (Ser925) și p130CAS (Tyr410) în celulele HCC1954. Asta în ciuda îmbunătățirii autofosforilării c-Src (Tyr416), implicând un mod de inhibare a activității de transformare a c-Src care diferă de cea a inhibitorilor clasici ai c-Src kinazei (de exemplu, dasatinib, saracatinib, bosutinib; ref. 43).

S-a raportat că oxidarea c-Src are ca rezultat heterodimerizarea și inactivarea acesteia (35), în timp ce altele au raportat o creștere a fosforilării c-Src Tyr416, rezultând în îmbunătățirea activității sale kinazice, tumorigeneză și metastază (36, 37, 44). Creșterea autofosforilării c-Src (Tyr416) ​​și creșterea activității kinazei au fost atribuite oxidării c-Src care are ca rezultat o legătură S - S covalentă între SH2 Cys245 și Cys487 din domeniul său kinazic (37). În schimb, oxidarea Cys277 în bucla de glicină c-Src GQGCFG este raportată ca rezultând oligomerizarea c-Src și pierderea activității c-Src (35), datorată probabil scăderii afinității c-Src pentru substraturile sale din aval. De remarcat, oxidarea c-Src de ROS indusă de MEDICA este prezentată aici pentru a avea ca rezultat abrogarea kinazei c-Src și transformarea activității, în timp ce crește concomitent fosforilarea sa Tyr416, ceea ce implică faptul că cele două moduri oxidative de modulare a activității c-Src nu sunt reciproc. exclusiv. Într-adevăr, oxidarea c-Src concomitentă de către cele două moduri oxidative poate duce la oligomeri c-Src inactivi având o conformație „deschisă” cu creșterea autofosforilării c-Src (Tyr416) ​​(Fig. 6D și G).

Suprimarea tumorii MMTV-PyMT de către MEDICA a condus la suprimarea masei tumorale, proliferarea, indicele mitotic și angiogeneza, promovând în același timp apoptoza tumorii. Cel mai important, suprimarea supraviețuirii tumorii a fost însoțită de o creștere a markerilor mamar de diferențiere, așa cum este evidentă de tumorile constând din structuri glandulare papilare, cu chisturi căptușite de epiteliu scuamos umplut cu lichid care conține cazeină. Profil de diferențiere similar a fost raportat anterior la șoarecii transgenici MMTV-PyMT tratați cu inhibitorul c-Src kinazei bosutinib (SKI606; ref. 45), precum și la șoarecii c-Src - nul (42), ceea ce implică inhibarea activității c-Src prin inhibitori ai kinazei, genetic sau prin oxidarea sa pot converge pe un fenotip similar.

Suprimarea creșterii tumorale MMTV-PyMT de către MEDICA este prezentată aici în continuare ca fiind însoțită de suprimarea metastazelor pulmonare. Suprimarea metastazei pulmonare poate fi atribuită suprimării tumorii primare, rezultând o probabilitate scăzută de diseminare a tumorii, completată de inhibarea tranziției epiteliale - mezenchimale (EMT) a celulelor tumorale. Într-adevăr, s-a constatat că tratamentul MEDICA induce îmbogățirea celulelor tumorale cu E-caderină membrană și β-catenină, însoțită de o scădere a transcrierii MMP9. Deoarece atât STAT3, cât și c-Src sunt inductori puternici ai EMT (46, 47), epitelializarea celulelor tumorale de către MEDICA poate fi parțial atribuită abrogării EMT. Suprimarea EMT de către MEDICA poate fi explicată parțial prin suprimarea transcripției Ezh2. Deoarece Ezh2 este implicat în controlul proliferării, diferențierii și apoptozei celulare (31, 32), suprimarea acestuia de către MEDICA poate explica în continuare suprimarea creșterii tumorii, promovând în același timp diferențierea tumorii.

Dezvăluirea potențialelor conflicte de interese

Jacob Bar-Tana deține participații (inclusiv brevete) la SyndromeX. Nici un potențial conflict de interese nu a fost dezvăluit de către ceilalți autori.

Contribuțiile autorilor

Concepție și proiectare: U. Gluschnaider, R. Hertz, J. Bar-Tana

Dezvoltarea metodologiei: U. Gluschnaider, R. Hertz, E. Pikarsky

Achiziționarea de date (animale furnizate, pacienți dobândiți și gestionați, facilități furnizate etc.): U. Gluschnaider, R. Hertz, S. Ohayon, E. Smeir, M. Smets

Analiza și interpretarea datelor (de exemplu, analiză statistică, biostatistică, analiză de calcul): U. Gluschnaider, R. Hertz, S. Ohayon, E. Pikarsky, J. Bar-Tana

Scrierea, revizuirea și/sau revizuirea manuscrisului: U. Gluschnaider, R. Hertz, E. Pikarsky, J. Bar-Tana

Suport administrativ, tehnic sau material (adică raportarea sau organizarea datelor, construirea bazelor de date): U. Gluschnaider

Supravegherea studiului: U. Gluschnaider, J. Bar-Tana

Altele (revizuirea articolului): U. Gluschnaider, E. Pikarsky

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc Dr. Itay Ben-Porat pentru că ne-a prezentat modelul MMTV-PyMT și Inbal Shamir pentru asistență în imunohistochimie.