Date asociate

Abstract

1. Introducere

În prezent, adulterarea suplimentelor alimentare (DS) cu medicamente aprobate sau neaprobate reprezintă o amenințare pentru sănătatea consumatorilor [1]. Adulterarea preparatelor de slăbire cu ingrediente farmaceutice active pentru a le crește efectele este o problemă larg raportată [2]. Cei mai comuni doi adulteranți detectați în preparatele pentru slăbit sunt sibutramina și fenolftaleina, singuri sau în combinație [3,4,5]. Sibutramina este un medicament anorectic care a fost retras de pe piața multor țări (Uniunea Europeană, SUA, China, Australia, India ...) din 2010 din cauza preocupărilor cardiovasculare. Fenolftaleina este utilizată pentru proprietățile sale laxative, chiar dacă a fost îndepărtată de pe piața produselor fără prescripție medicală la sfârșitul anilor '90 din cauza unui risc cancerigen [6].

Au fost propuse diferite metode analitice pentru detectarea și/sau cuantificarea medicamentelor nedeclarate în DS de slăbire. Cea mai frecvent descrisă tehnică este cromatografia lichidă cu detectare cu ultraviolete, diode-array sau spectrometrie de masă [7,8,9]. Au fost propuse alte metode, inclusiv spectroscopia vibrațională [10], cromatografia gazoasă [4] sau cromatografia cu schimb de ioni cu detectarea conductivității [11]. Spectroscopia RMN cu câmp înalt (HF) 1 H a fost, de asemenea, aplicată cu succes pentru detectarea și cuantificarea adulteranților în DS slăbire [5].

RMN cu câmp redus (LF) este o tehnică emergentă bazată pe utilizarea unei noi generații de RMN compactă [12,13,14]. Câteva aplicații ale RMN LF în domeniul farmaceutic au fost descrise recent [15,16,17,18,19] și s-a demonstrat fezabilitatea RMN LF pentru dezvăluirea adulterării DS [15,19].

Scopul prezentului studiu este de a aprofunda evaluarea RMN LF pentru a detecta adulterarea DS slăbind prin cuplarea datelor LF 1 H RMN cu o analiză chimiometrică, permițând astfel clasificarea eșantioanelor fără interpretarea de către experți a spectrelor RMN înregistrate pe un benchmark cu costuri reduse. spectrometru. Am analizat astfel DS slăbire adulterată și neadulterată, caracterizată anterior calitativ și cantitativ prin HF 1 H RMN [5], cu LF 1 H RMN pentru a crea modele statistice în care sunt injectate datele LF 1 H RMN de noi probe . Sunt discutate interesul și limitările acestei abordări.

2. Rezultate și discuții

2.1. Analiza LF 1 H RMN

Scăderea în greutate DS utilizată în acest studiu, cu excepția probelor de testare recent achiziționate (T), a fost analizată anterior și complet caracterizată prin HF 1 H RMN, adică natura și cantitatea de adulteranți pe unitate (capsulă, tabletă sau plic) erau cunoscuți [5]. Lista completă a DS este prezentată în Tabelul S1.

În prima etapă a prezentului studiu, toate DS au fost analizate în duplicat prin LF 1 H RMN în metanol deuterat. Timpul de înregistrare al fiecărui spectru a fost de 15,5 minute, iar profilurile probelor tipice sunt ilustrate în Figura 1 .

analiza

Spectre tipice LF 1 H RMN ale suplimentelor alimentare pentru scăderea în greutate înregistrate la 60 MHz (grupa N, neadulterată (naturală); S, grupul adulterat cu sibutramină; P, grupul adulterat cu fenolftaleină; PS, atât grupa adulterată cu sibutramină, cât și fenolftaleina ). Ph: fenolftaleină; Sib: Sibutramină; FA: Acizi grași; TSP: Referință internă; *: CD2HOD.

Deși spectrele LF 1 H RMN sunt destul de slab rezolvate, principalele semnale caracteristice ale sibutraminei și fenolftaleinei, cei doi adulteranți cei mai frecvenți ai DS de slăbire, sunt ușor de detectat singuri sau în combinație. După cum se poate vedea în Figura 1, sibutramina este identificată în probele S5 și PS2 prin semnalele protonilor săi aromatici la 7,41 ppm și ale grupărilor sale metil la 2,49 (CH3 12 și 13) și 1,02 (CH3 16 și 17) ppm. În mod similar, protonii aromatici ai fenolftaleinei dau un model caracteristic (6,5-8,0 ppm) care poate fi observat în DS P1 și PS2. Eșantionul N5 este un DS fără adulterant și, cu excepția semnalelor de referință și a solventului, doar semnalul unor protoni CH2 de acizi grași din extracte din plante este ușor detectat la 1,27 ppm. Semnalele minore corespunzătoare protonilor aromatici ai polifenolilor naturali sau altor compuși naturali sunt, de asemenea, detectate în câteva probe.

2.2. Analiza chimiometrică

Pentru a începe analiza chimiometrică, a fost construit un model statistic prin efectuarea unei comparații în două clase: DS fără adulterant (natural: N, n = 19) au fost comparate cu DS care conținea fie sibutramină (S, n = 12), fie fenolftaleină (P, n = 9), probele (S) și (P) fiind considerate împreună (n = 21) ca „probe adulterate”. După procesarea spectrelor (regiunea 6-8 ppm, a se vedea partea experimentală), colectarea și normalizarea datelor, Analiza Discriminantă Partial Least Squares (PLS-DA) a condus la un model predictiv cu două componente PLS principale și criterii de validare bune (Q 2 = 0,61, R 2 Y = 0,76, CV-ANOVA = 2,3 × 10 −18). Toate valorile Q2 și R2 au fost mai mici în testul de permutare decât în ​​model, confirmând bunătatea acestuia. Clasificarea tuturor eșantioanelor a fost apoi obținută din modelul din două clase bazat pe valorile Y prevăzute (YpredPS, care este valoarea Y prezisă de model pe baza variabilelor blocului X (intensități de rezonanță la ppm date)) indicând probabilitatea ca un eșantion să aparțină unei clase a modelului (adulterat sau nealterat).

tabelul 1

Lista de clasificare care prezintă valorile Y prevăzute (YPredPS) pentru probele de testare (T) pe baza modelului PLS-DA de două clase construit cu date LF 1 H RMN și completat prin observarea vizuală a proiecției probelor pe trei modelul clasei PLS-DA prezentat în Figura 3 A.

Identificare Clasificare predictivă a valorii Y
din proiecția PLS-DAP cu două clase pe modelul PLS-DA cu trei clase prezentat în Figura 3 AYPredPSClassificationClass Membership Adulterant
T10,18naturalN-
T20,37la limitaPfenolftaleina
T30,16naturalN-
T40,17naturalN-
T50,18naturalN-
T60,79alteratPfenolftaleina
T70,30la limitaPfenolftaleina
T80,17naturalN-
T90,45alteratSsibutramină
T100,17naturalN-
T110,17naturalN-
T120,69alteratSsibutramină
T130,65alteratSsibutramină

Pentru a merge mai departe în clasificarea DS, a fost efectuată o nouă analiză PLS-DA în care probele (N), (P) și (S) au fost considerate ca trei grupuri distincte. Un model predictiv bun a fost obținut cu două componente PLS principale (Q 2 = 0,66, R 2 Y = 0,74), o valoare p a CV-ANOVA de 3,4 × 10 −21 și un test de permutare efectuat cu succes. Scorul grafic al acestui PLS-DA de trei clase arată o discriminare clară între cele trei categorii de DS (Figura 3 A). Probele (P) (albastru închis) și (S) (verde) par mai răspândite decât mostrele (N) (galben) din cauza cantității variabile de adulterant din fiecare probă variind de la 8 la 16 mg pe unitate pentru sibutramină în probe ( S) și de la 5 la 55 mg pe unitate pentru fenolftaleină în probe (P) [5].

(A) Scorul grafic al modelului de trei clase PLS-DA construit din spectrele LF 1 H RMN ale probelor N (neadulterate), S (adulterate cu sibutramină) și P (adulterate cu fenolftaleină). Scor parcele (B), (C) și (D) arată proiecția eșantioanelor PS (adulterate atât cu sibutramină, cât și cu fenolftaleină), T (eșantioane de testare) și X (eșantioane atipice, vezi text), respectiv pe modelul construit (A).

Probele (PS) (violet) proiectate în acest model de trei clase PLS-DA sunt situate mai aproape de probele (P) decât de (S) (Figura 3 B). Această observație este în acord cu cantități mai mari de fenolftaleină comparativ cu sibutramina conținută în majoritatea probelor [5]. Graficul punctaj al proiecției probelor de testare (T) în model confirmă clasificarea propusă în Tabelul 1, dar oferă o analiză mai precisă (Figura 3 C). Într-adevăr, probele T1, T3-5, T8, T10 și T11 se suprapun cu probele (N) și pot fi astfel considerate naturale. Probele T9, T12 și T13 conțin sibutramina adulterantă în timp ce probele T2, T6 și T7 conțin fenolftaleină. Se poate observa că niciuna dintre probele (T) nu aparține clasei (PS), adică nu conține un amestec de fenolftaleină și sibutramină. Deoarece analiza statistică a probelor (T) a fost făcută orbește, adică fără o examinare amănunțită a spectrelor lor de RMN HF (și HF) 1 H, aceste descoperiri au fost confirmate de analiza vizuală a acestor spectre.

Faptul că cele două eșantioane T2 și T7 au fost considerate ca fiind limită în clasificarea stabilită din valorile Y prevăzute pentru modelul anterior cu două clase (Tabelul 1), dar sunt acum mai bine caracterizate prin modelul cu trei clase (Figura 3 C) poate fi explicat și prin observarea vizuală a spectrelor lor LF 1 H RMN. Într-adevăr, așa cum sa raportat în Figura 4, semnalele de fenolftaleină sunt detectate în probele T2 și T7, dar cu un raport semnal/zgomot mai scăzut decât în ​​spectrul P1 din cauza cantității reduse de adulterant din aceste DS. Am menționat mai sus că semnalele corespunzătoare protonilor aromatici ai polifenolilor naturali sau altor compuși naturali au fost detectați în câteva probe (N) (ca ilustrație, spectrul LF 1 H RMN al probei N6 este prezentat în Figura 4). Schimbările și intensitățile lor chimice apropiate de cele observate pentru fenolftaleină în probele T2 și T7 au condus la clasificarea acestor DS ca limită în prima abordare (Tabelul 1).

Spectre LF 1 H RMN ale unor suplimente alimentare de slăbit înregistrate la 60 MHz. Ph: fenolftaleină; Sib: sibutramină.

În concluzie, PLS-DA de trei clase funcționează bine, deoarece permite o predicție corectă a naturii sibutraminei adulterante sau fenolftaleinei, cele două medicamente interzise adăugate cel mai frecvent la scăderea în greutate DS pentru a-și îmbunătăți eficacitatea. Cea mai mică limită a concentrației de fenolftaleină detectată de model este de 3 mg la 100 mg de pulbere, ceea ce corespunde la ± 6 mg pe unitate dacă se ia în considerare un conținut mediu de capsulă de 200 mg. Cea mai mică limită a concentrației de sibutramină nu a putut fi atinsă, deoarece toate DS-urile analizate au avut valori YPredPS> 0,7, foarte departe de valoarea 0,3 care caracterizează limita dintre DS adulterat și non-adulterat (Figura 2). O sursă de eroare de clasificare este totuși posibilă dacă un adulterant sau un compus natural are o structură care duce la semnale RMN 1 H în zonele de frecvență de rezonanță considerate a construi modelul. De exemplu, semnalul caracteristic al protonilor metilici 16 și 17 al sibutraminei la 1,02 ppm nu a putut fi utilizat pentru a crea modelul, deoarece a fost adesea suprapus cu rezonanța acizilor grași.

Acest studiu arată că aplicarea unui tratament chimiometric la datele LF 1 H RMN este un mijloc de extindere a câmpului de aplicare a tehnicii, în special pentru analiza amestecurilor complexe. Această abordare a fost propusă cu succes în aplicațiile agroalimentare pentru analiza și autentificarea uleiurilor comestibile [21,22] și a cărnii [23]. Foarte recent, a fost utilizată o abordare similară pentru analiza medicamentelor necorespunzătoare și falsificate [19]. Studiul nostru extinde domeniul la adulterarea DS, o problemă la răscrucea dintre produsele agroalimentare și cele pentru sănătate. În cazul adulterării DS de slăbire, procesul analitic propus poate fi util pentru detectarea în prima linie a probelor susceptibile de a fi adulterate fără a recurge la analiza expertă a spectrelor 1H RMN. Pregătirea eșantionului este simplă și rapidă, iar achiziționarea LF 1 H RMN este ușoară, destul de apăsată și nu necesită cunoștințe specifice RMN. Perspectiva acestui studiu ar fi automatizarea întregului proces pentru a propune o metodă la cheie care ar putea fi implementată în laboratoarele de control al calității.

3. Materiale și metode

3.1. Mostre

Diferite grupuri de slăbire DS au fost comandate pe Internet și analizate cu LF 1 H RMN: (N) fără adulterare, (S) adulterare cu sibutramină, (P) adulterare cu fenolftaleină, (PS) adulterare atât cu fenolftaleină, cât și sibutramină, (T) probe de testare și (X) două probe atipice (Tabelul S1). 40 DS utilizate pentru construirea modelelor statistice (N) (n = 19), (S) (n = 12) și (P) (n = 9)), precum și eșantioane (PS) (n = 11), iar cele două DS (X) au fost caracterizate anterior calitativ și cantitativ în laboratorul nostru cu HF 1 H RMN [5]. Pentru testarea modelelor statistice, 13 noi DS (T1 - T13) au fost cumpărate pe internet în noiembrie 2019 și au fost analizate de LF și HF 1 H RMN la primire.

3.2. Pregătirea probei pentru analiza LF 1 H RMN

Aproximativ 100 mg de probe sub formă de pulbere au fost amestecate cu 1 ml de metanol deuterat sub agitare cu vortex timp de 15 s și apoi sonicate timp de 5 min. Suspensia a fost apoi centrifugată (5 min, 3000 rpm) și supernatantul (700 uL) analizat. Treizeci de microlitri de 2,2,3,3-tetradeutero-3- (trimetilsilil) propanoat (TSP, 40 mM) ca referință de deplasare chimică internă au fost adăugate înainte de analiza RMN. Fiecare DS a fost pregătit în duplicat.

3.3. Analiza LF 1 H RMN

Spectrele calitative LF 1 H RMN au fost achiziționate pe un spectrometru RMN de pe bancă Pulsar ™ (Oxford Instruments, Abingdon, Marea Britanie) care funcționează la o frecvență de 59,7 MHz pentru 1 H. Temperatura din interiorul spectrometrului a fost de 310 K. Achiziția a fost efectuată utilizând Software-ul SpinFlow 1.2.0.1 (Oxford Instruments) și procesarea s-au făcut cu MNova 11.0 (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spania). Dezintegrările libere de inducție (FID) au fost înregistrate cu un unghi de rotație de 90 ° (12,5 μs), o lățime spectrală de 5000 Hz (83,75 ppm) și 8 K puncte complexe (timp de achiziție de 1,64 s). Întârzierea de relaxare a fost stabilită la 2 secunde și s-au înregistrat 256 de tranzitori, conducând la un timp total de achiziție de 15,5 minute. Pentru procesarea datelor, FID-urile au fost apodizate cu un filtru exponențial (lărgirea liniei (LB) de 0,3 Hz) și s-a aplicat un neted Whittaker pentru corectarea automată a liniei de bază. Numărul de puncte a fost mărit la 16 K în spectrele transformate de Fourier. Semnalul TSP setat la 0 ppm a fost utilizat ca referință internă pentru măsurarea deplasării chimice (δ).

3.4. Chimiometrie