Krystyna Zych, Andrei Perepelov, Agata Baranowska, Agnieszka Zabłotni, Alexander S. Shashkov, Yuriy A. Knirel, Zygmunt Sidorczyk, Structura O-polizaharidei și studii serologice ale lipopolizaharidei Proteus penneri 60 clasificate într-un nou serogrote Proteus Microbiologie medicală, volumul 43, numărul 3, martie 2005, paginile 351–356, https://doi.org/10.1016/j.femsim.2004.09.004

structura

Abstract

1. Introducere

Bacteriile gram-negative oportuniste în formă de tije din genul Proteus sunt o cauză comună a infecțiilor tractului urinar la persoanele cu tract urinar anormal structural sau catetere urinare pe termen lung [1]. Acestea provoacă bacteriurie semnificativă în principal în vezică, dar au și înclinație pentru rinichi. Infecțiile proteice sunt probabil cele mai cunoscute pentru asocierea lor cu o formare de pietre debilitante la rinichi și vezică urinară [2]. În genul Proteus, există patru specii importante din punct de vedere clinic: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri și Proteus hauseri [3]. S-au identificat mulți factori de virulență ai acestor organisme, inclusiv mai multe tipuri de fimbrii, hemolizine, flageli, invazivitate, creștere roșie, enzime, inclusiv proteaze și uree, polizaharide capsulare și lipopolizaharide (LPS, endotoxină) [4, 5].

Specificitatea serologică a tulpinilor Proteus este definită de structura chimică a lanțului O-polizaharid al LPS (antigenul O). Pe baza antigenelor O, tulpinile a două specii, P. mirabilis și P. vulgaris, au fost clasificate mai întâi în 49 O-serogrupuri [6] și mai târziu în 11 serogrupuri suplimentare [7]. Au fost propuse aproximativ 15 serogrupuri suplimentare pentru a treia specie importantă din punct de vedere medical, P. penneri [8, 9]. O-polizaharidele celor mai multe tulpini P. penneri studiate până acum sunt acide datorită prezenței acizilor uronici și a diferitelor componente acide fără zahăr, precum aminoacizii, acizii lactici și piruvici și grupările fosfat [8-12]. Raportăm acum despre structura unei alte O-polizaharide fosforilate acide izolate din tulpina P. penneri 60. Pe baza structurii chimice unice a O-polizaharidei și a unei reactivități serologice slabe a O-antiserului împotriva P. penneri 60 cu Proteus LPS, tulpina P. penneri 60 a fost clasificată într-un nou serogrup Proteus O70 separat.

2. Materiale și metode

2.1 Tulpini bacteriene și creștere

Proteus penneri 60 a fost izolat din urina unei femei cu bacteriurie într-un spital din Łódz (Polonia). P. vulgaris O8 (17/57), O15 (30/57) și O19 (37/57) provin din Colecția Națională Cehă de Culturi de Tip (CNCTC, Institutul de Epidemiologie și Microbiologie, Praga, Republica Cehă).

Bacteriile au fost cultivate pe bulion de nutrienți (Laboratorul Varșovia din Sera și Vaccinuri, Polonia) suplimentat cu 1% glucoză. Masa bacteriană uscată a fost obținută din cultura aerată așa cum s-a descris anterior [13].

2.2 Izolarea și degradarea lipopolizaharidei

LPS a fost izolat din celulele bacteriene uscate de P. penneri 60 prin extracție cu fenol apos fierbinte [14] și purificat prin tratament cu 50% CCl3CO2H apos rece (4 ° C) urmat de dializă a supernatantului. Randamentul LPS a fost de 4,6% din masa bacteriană uscată (g/g).

Hidroliza acidă ușoară a LPS (100 mg) a fost efectuată cu HOAc apos 2% la 100 ° C până la precipitarea lipidei A. Precipitatul a fost îndepărtat prin centrifugare (13.000 g, 20 min), iar supernatantul a fost fracționat prin cromatografie cu permeație pe gel ( GPC) pe o coloană (56 × 2,6 cm) de rășină Sephadex G-50 (S) (Pharmacia, Suedia) în tampon acetat de piridiniu 0,05 M (pH 4,5), cu monitorizare utilizând un refractometru diferențial Knauer (Germania). Randamentul oligozaharidei rezultate a fost de 17% din greutatea LPS.

O-dezacilare alcalină ușoară a LPS (75 mg) a fost efectuată cu amoniac apos 12,5% (37 ° C, 16 ore). Precipitatul a fost îndepărtat prin centrifugare (13.000 g, 20 min), iar supernatantul a fost fracționat prin GPC pe o coloană (80 × 2,5 cm) de TSK HW-40 în HOAc apos 1%. Randamentul LPS tratat cu alcali (LPS-OH) a fost de 40% din LPS (g/g).

2.3 Antiser de iepure și teste serologice

O-antiserul policlonal a fost obținut prin imunizarea iepurilor cu bacterii inactivate la căldură de P. penneri 60 conform procedurii publicate [15]. SDS - PAGE folosind 12% acrilamidă, imunoblotare, absorbție, test enzimatic imunosorbent (EIA) folosind LPS și imunohemoliză pasivă (PIH) folosind LPS tratat cu alcali ca antigen, precum și experimente de inhibare au fost efectuate așa cum a fost descris în detaliu anterior [16].

2.4 Analiza zahărului

LPS-OH a fost defosforilat cu 48% HF apos (7 ° C, 16 h) urmat de hidroliză cu 2 M CF3CO2H (120 ° C, 2 h), monozaharidele au fost reduse cu 0,25 M NaBH4 în 1 M amoniac apos (25 °) C, 1 h), acetilat cu un amestec 1: 1 (v/v) de piridină și anhidridă acetică (120 ° C, 30 min) și analizat prin GLC. Configurațiile absolute ale monozaharidelor au fost determinate de GLC a glicozidelor (+) - 2-butil acetilate [17, 18]. Ca referință pentru FucNAc s-a folosit polizaharida P. vulgaris O8 conținând l-FucNAc. GLC a fost efectuat folosind un instrument Hewlett - Packard 5890 Seria II echipat cu o coloană de silice condensată HP-1 (0,20 mm × 25 m) și un program de temperatură de 170-180 ° C la 1 ° C min -1 urmat de un program de 180–230 ° C la 7 ° C min -1 .

2.5 Analiza metilării

Metilarea LPS-OH (2 mg) a fost efectuată cu CH3I în dimetilsulfoxid în prezența metilsulfinilmetanidei de sodiu [19]. Monozaharidele parțial metilate au fost derivate prin hidroliză în aceleași condiții ca în analiza zahărului, transformate în acetați de alditol și analizate prin GLC - MS pe un spectrometru de masă TermoQuest Finnigan model Trace GC 2000 echipat cu o coloană EC-1 (0,32 mm × 30 m), folosind un gradient de temperatură de 150 (2 min) la 250 ° C la 10 ° C min -1 .

2.6 Spectroscopie RMN

Spectrele RMN 1 H, 13 C și 31 P au fost înregistrate cu un spectrometru Bruker DRX-500 în D2O la 20 ° C folosind acetonă internă (δH 2.225, δC 31.45) sau H3PO4 apos extern 85% (δP0) ca referințe. Experimente unidimensionale și bidimensionale au fost efectuate folosind secvențe de impuls standard și datele obținute au fost prelucrate utilizând software-ul Bruker XWINNMR 2.6.

3. Rezultate si discutii

3.1 Studii structurale

Lipopolizaharida (LPS) a fost izolată din P. penneri 60 prin procedeul fenol-apă [14]. Hidroliza acidă ușoară a LPS (date neprezentate) a dat o oligozaharidă fosforilată, cel mai probabil, datorită scindării lanțului O-polizaharid la o legătură glicozil fosfat sensibil la acid. Prin urmare, pentru determinarea structurii O-polizaharidelor, LPS a fost O-deacilat în condiții alcaline ușoare pentru a produce un polimer numit LPS-OH (LPS tratat cu alcali).

Analiza zahărului utilizând GLC a acetaților de alditol după defosforilare cu HF apos 48% urmată de hidroliza acidă completă a LPS-OH a relevat glucoză și galactoză, precum și 2-amino-2,6-dideoxigalactoză (FucN) și GlcN în raport

1: 1: 1: 1. Analiza GLC a glicozidelor acetilate cu (+) - 2-butanol a arătat că Glc, Gal și GlcN au configurația d și FucN are configurația l. Identitatea și configurația absolută a celei de-a cincea componente de zahăr a unității repetate ca d-Qui4NAc a fost stabilită pe baza efectelor de glicozilare în spectrul RMN 13 C al LPS-OH [20]. Analiza metilării LPS-OH a dus la identificarea derivaților din Glc substituit cu 6, FucNAc substituit cu 3 și GlcNAc substituit cu 3.

Spectrul de 31 P RMN al LPS-OH a arătat un semnal pentru o grupă monofosfat la δ 3,55. Spectrul de 13 C RMN conținea semnale pentru cinci atomi de carbon anomeri la δ 96,5–104,0, un grup HOC2 - C nesubstituit la δ 61,1, un grup P - OC2 - C la δ 66,4 (date DEPT și 1 H bidimensional, 31 P experimente HMQC), un grup C - OC2 - C la δ 69,3 (date din spectrul DEPT), trei atomi de carbon care conțin azot aminoacizi la δ 49,4-57,8, două grupe C3 - C de zaharuri 6-deoxiamino la δ 16,6 și 17,7, alți atomi de carbon ai inelului zahăr la δ 68,1–78,3 și trei grupări N-acetil (CH3 la δ 23,2–23,6, CO la δ 174,6–175,6) (Fig. 1). Absența din spectrul de 13 C RMN a semnalelor din regiunea δ 82-88 caracteristice furanozidelor [21] a arătat că toate monozaharidele sunt în formă piranoză. În consecință, spectrul 1H RMN al LPS-OH a arătat semnale pentru cinci protoni anomeri din regiune la δ 4.50-5.50, două grupări metil de 6-deoxiaminosugari la δ 1.19 și 1.23, grupări N-acetil la δ 1.94-2.00 și alți protoni la δ 3.46–4.48. Prin urmare, O-polizaharida are o unitate de repetare a pentazaharidei fosforilate.

Spectrul RMN 13 C al LPS-OH al P. penneri 60.