Shanthi Ganesan

1 Departamentul de Științe Animale, Universitatea de Stat din Iowa, Ames, Iowa,

Olga Volodina

1 Departamentul de Științe Animale, Universitatea de Stat din Iowa, Ames, Iowa,

Sarah C. Pearce

1 Departamentul de Științe Animale, Universitatea de Stat din Iowa, Ames, Iowa,

Nicholas K. Gabler

1 Departamentul de Științe Animale, Universitatea de Stat din Iowa, Ames, Iowa,

Lance H. Baumgard

1 Departamentul de Științe Animale, Universitatea de Stat din Iowa, Ames, Iowa,

Robert P. Rhoads

2 Departamentul de științe ale animalelor și păsărilor, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia,

Joshua T. Selsby

1 Departamentul de Științe Animale, Universitatea de Stat din Iowa, Ames, Iowa,

Abstract

Introducere

Expunerea hipertermică prelungită pare să fie în contrast puternic cu hipertermia terapeutică în timpul căreia hipertermia scurtă (aproximativ 30 min) atenuează atrofia musculară (Naito și colab. 2000; Selsby și Dodd 2005), cresc creșterea musculară (Selsby și colab. 2007; Takeuchi și colab. 2014) și menține sensibilitatea la insulină (Gupte și colab. 2011). Hipertermia prelungită apare, de asemenea, distinctă de modificările care apar la modelele de căldură, care au adesea o durată de aproximativ 2 ore și pot include o componentă a exercițiului. În special, interleukina-6 (IL-6) este puternic indusă în mușchi în timpul loviturii de căldură și pare a fi citoprotectoare pentru un număr de sisteme de organe (Welc și colab. 2012), cu toate acestea, este tocită pe parcursul a 12 ore de expunere hipertermică ( Ganesan și colab. 2016). Mai mult, lovitura de căldură pare să inducă semnalizarea inflamatorie prin AP-1, dar nu prin NF-κB (Welc și colab. 2013b), în timp ce expunerea hipertermică mai prelungită activează atât AP-1, cât și NF-κB (Ganesan și colab. 2016).

Materiale și metode

Animale și design de studiu

Toate procedurile au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Iowa State University (protocolul nr. 2-12-1230 - S). Un proiect experimental detaliat și date fenotipice au fost publicate anterior (Pearce și colab. 2014). Pe scurt, 32 de femele cu o greutate corporală medie de 63,8 ± 2,9 kg au fost repartizate aleatoriu în patru grupuri. Porcii martori (n = 8) au fost ținuți în condiții termoneutrale timp de 6 ore (0 h stres termic; 21 ° C;

70% umiditate), în timp ce animalele din alte grupuri au fost expuse la condiții de stres termic (37 ° C;

40% umiditate) timp de 2 ore (n = 8), 4 ore (n = 8) sau 6 ore (n = 8). Accesul ad libitum la hrană și apă a fost asigurat pentru toate animalele, iar dieta a îndeplinit cerințele Subcomitetului pentru nutriția porcinelor, Comitetului pentru nutriția animalelor, Comitetului pentru agricultură și Consiliului Național de Cercetare (1998) pentru hrana și gestionarea porcilor. Temperatura și umiditatea mediului au fost înregistrate la fiecare 5 minute de un aparat de înregistrare a datelor (Lascar ® EL - USB - 2 - LCD, Erie, PA). Temperatura rectală, frecvența respiratorie și aportul de furaje au fost înregistrate la fiecare două ore. Odată ce tratamentul de mediu a fost finalizat, animalele au fost ucise prin supradozaj cu barbiturice și exsanguinare, iar mușchiul roșu semitendinos (STR) a fost recoltat imediat și depozitat la -80 ° C. STR a fost selectat pentru analiză, deoarece am descoperit anterior un grad ridicat de disfuncție hipertermică, în timp ce porțiunea glicolitică, albă a ST este comparativ rezistentă la hipertermie.

Extracția proteinelor și imunochimia

tabelul 1

Anticorpi și diluții utilizate în imunoblotare

Anticorpi Diluție primară Diluare secundară Companie/nr
Proteina de șoc termic (HSP70)1: 10001: 2000Enzo Life Sciences: C95F3A-5
Proteină de șoc termic (HSP60)1: 7501: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 12165
Proteina de șoc termic (HSP90)1: 10001: 3000Tehnologie de semnalizare celulară: 4874
Stres - protein kinaze activate (SAPK)/c - Jun N - kinaze terminale (JNK)1: 10001: 3000Tehnologie de semnalizare celulară: 9251
phospho - SAPK/JNKThr183/Tyr1851: 10001: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 9251
Factor nuclear kappa - lanț ușor - amplificator al celulelor B activate (NF - κB p65)1: 50001: 3000Tehnologie de semnalizare celulară: 8242
fosfo - NF - κB p65 Ser536 1: 10001: 1000Tehnologie de semnalizare celulară: 3033
Factor nuclear kappa - subunitate alfa kinază alfa (IKKα)1: 10001: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 2682
Factorul nuclear al amplificatorului genei polipeptidice kappa light în inhibitorul celulelor B, alfa (IKBα)1: 20001: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 9242
Factor alfa de necroză tumorală (TNFα)1: 20001: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 3707
Interleukina-6 (IL-6)1: 5001: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 12153
Interleukina-1β 1: 5001: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 12242
Janus Kinase (JAK1)1: 10001: 2000Tehnologie de semnalizare celulară: 3341
Janus Kinase (JAK2)1: 10001: 2000Biotehnologie Santa Cruz: SC294
Traductor de semnal și activator de transcriere (STAT3)1: 10001: 3000Tehnologie de semnalizare celulară: 4904
phospho - STAT3 Tyr705 1: 7501: 1000Tehnologie de semnalizare celulară: 9131

Izolarea ARNm și RT - qPCR

masa 2

Secvențe pentru primerii RT - qPCR

Grund TargetForward Grund invers Ta, ° C
18Sctctagataacctcgggccggtcgggagtgggtaatttgc60.0
IL-2ggtgcacctacttcaagctcctccctccagagctttgagt64.4
IL-6agatgccaaaggtgatgccactcagggtctggatcagtgc65.7
IL-1β ccaaagagggacatggagaattatatcttggcggcctttg62.2
IL-8gaaatcacaggatgcccagttgcaagttgaggcaagaaga61,8
IL-10tgtgccctatggtgttcaacctttgtcacactccggaagc59.7
IL-15tcctggagttacgcgtcattttttcctccagctcctcaca62.2
TNFa gcccttccaccaacgttttctcccaggtagatgggttcgt66,9

analize statistice

inflamatorie

Efectul stresului termic pe termen scurt asupra proteinelor de șoc termic din mușchii scheletici oxidativi. Abundența relativă de proteine ​​a HSP 60, HSP 70 și HSP 90 au fost măsurate folosind western blot (A). Sunt incluse pete reprezentative (B). Pata Ponceau S (PS) a fost utilizată ca control al încărcării. Valorile sunt medii ± SE; n = 8/grup. # Indică o diferență semnificativă în comparație cu 2 h de stres termic, P 2 A și B). IKKα fosforilează IKBα, un inhibitor endogen al NF - κB și duce la degradarea ulterioară a acestuia. Abundența de proteine ​​a IKBα a fost similară între grupuri. Abundența totală de proteine ​​NF - κB a crescut cu aproximativ 40% după 6 ore de stres termic comparativ cu toate celelalte grupuri, care erau similare între ele (P 2 A și B). Abundența de proteine ​​a NF-κB fosforilat a fost similară între grupuri. Abundența relativă de NF - κB total și fosforilat în fracția nucleară a fost, de asemenea, similară între grupuri (Fig. 2 C și D).