SuJean Choi, Regina Sparks, Mark Clay, Mary F. Dallman, Șobolanii cu obezitate hipotalamică sunt insensibili la injecțiile cu leptină centrală, Endocrinologie, volumul 140, numărul 10, 1 octombrie 1999, paginile 4426–4433, https://doi.org/ 10.1210/endo.140.10.7064

șobolanii

Abstract

Homeostazia energetică, care este un echilibru între aportul de energie, metabolism, stocare și cheltuială, este o funcție complexă de reglare, îndeplinită în principal de hipotalamus (1). Întreruperea oricăreia dintre aceste componente ale echilibrului energetic poate duce la patologii care variază de la tulburări de irosire sau anorexie la obezitate, care este o problemă majoră de sănătate care apare în societățile moderne (2). Deși fiecare subdiviziune a hipotalamusului poate contribui la reglarea echilibrului energetic, cei patru nuclei din hipotalamusul medial, nucleii paraventriculari (PVN), arcuați (ARC), ventromediali (VMN) și dorsomediali (DMN) sunt cu siguranță contribuabili majori. Aceste patru grupuri de celule primesc semnale de stare energetică, inclusiv leptina, care este o peptidă sintetizată și eliberată de țesutul adipos care leagă forma lungă a receptorilor de leptină (Ob-Rb) (3).

Mai multe modele genetice de obezitate demonstrează că grupurile celulare strâns alipite din hipotalamusul medial sunt locuri critice de acțiune pentru semnale de stare energetică. Cu toate acestea, demonstrarea consecințelor din aval ale acestor semnale este esențială pentru delimitarea mecanismelor de reglare a energiei. Deși receptorii de leptină se găsesc în mai multe grupuri de celule hipotalamice mediale, doar leziunile VMN au fost combinate cu injecții acute de leptină intracerebroventriculare (icv) (12). Astfel, obiectivul nostru a fost să măsurăm efectele unei singure injecții cu leptină ICV după leziunile colchicinei la PVN, VMN, ARC sau DMN, precum și să comparăm hrana și modelele metabolice după astfel de leziuni.

Apropierea fizică strânsă a grupurilor de celule hipotalamice mediale face dificilă lezarea fiecărui sit în mod selectiv pentru determinarea rolului (funcțiilor) funcțional (e) în reglarea echilibrului energetic. Leziunile electrolitice sau neurochimice (14) nu se limitează cel mai adesea la nucleul de interes. În schimb, volume mici de colchicină pot fi injectate selectiv în limitele grupurilor de celule specifice (Fig. 2) unde agentul este preluat de neuroni (15) și ulterior întrerupe funcția (16).

Schematică propunând atât căile de hrănire, cât și căile metabolice între cele patru grupuri de celule hipotalamice mediale. Săgețile drepte reprezintă unele, dar nu toate, căile de proiecție anatomice. Săgețile curbate, umplute reprezintă ieșiri stimulatoare; săgeata curbată, întreruptă, reprezintă ieșirea inhibitoare. Ob-Rb, Prezența formei lungi a receptorului de leptină.

Schematică propunând atât căile de hrănire, cât și căile metabolice între cele patru grupuri de celule hipotalamice mediale. Săgețile drepte reprezintă unele, dar nu toate, căile de proiecție anatomice. Săgețile curbate, umplute reprezintă ieșiri stimulatoare; săgeata curbată, întreruptă, reprezintă ieșirea inhibitoare. Ob-Rb, Prezența formei lungi a receptorului de leptină.

Imagine capturată video a secțiunilor colorate cu violet crezil (stânga) și colorate cu fluoresceină-colchicină (dreapta) din creierele șobolanilor (masculin Sprague Dawley; 220-240 g) cu injecții bilaterale de 100 nl de 1 μg colchicină și 1 μg fluoresceină -colchicina în structura hipotalamică medială indicată. 3V, al treilea ventricul. Bara de scalare, 500 μm.

Imagine capturată video a secțiunilor colorate cu violet crezil (stânga) și colorate cu fluoresceină-colchicină (dreapta) din creierele șobolanilor (masculin Sprague Dawley; 220-240 g) cu injecții bilaterale de 100 nl de 1 μg colchicină și 1 μg fluoresceină -colchicina în structura hipotalamică medială indicată. 3V, al treilea ventricul. Bara de scalare, 500 μm.

Materiale și metode

Am folosit șobolani Sprague Dawley masculi adulți (Bantin & Kingman, Fremont, CA), cu o greutate de 200-240 g. Animalele au fost adăpostite și întreținute individual pe un ciclu întunecat de 12 ore de lumină, 12 ore (luminile de la 0700 de ore) și au avut acces gratuit la purina șobolan Purina (5008, Ralston Purina Co., St. Louis, MO) și apă. Consumul de alimente și apă și greutatea corporală au fost măsurate la 0900 și 1700 h, cu 2 zile înainte de operație și timp de 5 zile după operație. Consumul de alimente a fost calculat prin cântărirea alimentelor plasate în coșurile pentru alimente și scăderea greutății alimentelor neingestate și vărsate la sfârșitul fiecărei perioade de măsurare. Experimentele și procedurile au fost aprobate de comitetul de cercetare pe animale de la Universitatea din California, San Francisco.

Interventie chirurgicala

Animalele au fost anesteziate cu un cocktail de rozătoare format din ketamină-xilazină-acepromazină (77: 1,5: 1,5 mg/kg; 1 ml/kg, ip) și plasate într-un aparat stereotaxic. Fiecare sit hipotalamic din linia mediană a fost injectat bilateral folosind o microseringă Hamilton (calibru 25) sub anestezie în ziua 0, fie cu o soluție de colchicină (1 μg/0,1 μ l) amestecată cu fluoresceină-colchicină (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) sau soluție salină (0,1 μl). Fluoresceina-colchicină este inactivă, dar a fost utilizată pentru a determina amplasarea locurilor de injectare și pentru a estima răspândirea injectatului. Injecțiile bilaterale ale medicamentului sau ale vehiculului au fost făcute în ARC (n = 22), VMN (n = 25), PVN (n = 17) și DMN (n = 23) folosind coordonatele bazate pe atlasul Paxinos și Watson 17 ). Bara incisivă superioară a fost poziționată la -3,3 mm sub zero orizontală și următoarele coordonate stereotaxice au fost utilizate pentru cele patru grupuri de celule hipotalamice: din bregma: VMN: anterior/posterior (AP), -2,5 mm; medial/lateral (ML), ± 0,7 mm; dorsal/ventral (DV), 9,2 mm; DMN: AP, -2,8 mm; ML, ± 0,7 mm; DV, 8,4 mm; ARC: AP, -2,4 mm; ML, ± 0,3 mm; DV, 10,0 mm; și PVN: AP, - 1,8 mm; ML, ± 0,5 mm; DV, 8,4 mm. Deteriorarea presiunii și refluxul au fost reduse prin injectarea vehiculului sau a medicamentului pe o perioadă de 1 minut și așteptarea a 5 minute după injecții înainte de îndepărtarea microsiringei.

În momentul injecțiilor hipotalamice, o canulă de ghidaj cu ecartament 22 (Plastics One, Roanoke, VA) a fost implantată într-un ventricul lateral pentru injectarea ulterioară de 3 μg de leptină sau vehicul (3 μl) în ziua 1 post-chirurgicală.

Colectie de mostre

În ziua 5 postchirurgicală, probele de sânge au fost prelevate dimineața (0900-1030 h) prin decapitare. Sângele portbagaj (5 ml) a fost colectat în tuburi care conțin 0,3 m EDTA disodic (100 μl/tub). Creierele au fost imediat postfixate în 10% formalină timp de 24 de ore și apoi depozitate într-o soluție de zaharoză 30%. Creierele au fost tăiate la 30 μm, iar tipul acului de injecție a fost localizat în secțiuni colorate cu violet crezil; fluorescența din fluoresceina-colchicină injectată a fost localizată în secțiuni adiacente (Fig. 2). Șobolanii au fost incluși în studiu numai dacă tipul acului a fost clar direcționat către nucleul dorit, iar fluorescența a fost în limitele grupului celular și nu s-a extins la grupurile vecine de interes. În plus față de probele de sânge și creierul, am colectat BAT interscapulară (iBAT) și țesut adipos alb (WAT) din perirenal, epididimal, sc (inghinal) și situri mezenterice. BAT a fost colectat și curățat de WAT pentru măsurarea conținutului UCP.

Probele de sânge au fost centrifugate la 3000 rpm la 4 ° C pentru a separa plasma, care a fost stocată ulterior la -20 ° C. Insulina plasmatică și leptina au fost măsurate folosind insulină de șobolan și truse RIA de leptină (Linco Research, Inc., St. Charles, MO). UCP a fost măsurat ca anterior (18), utilizând reactivi furnizați de Dr. Jean Himms-Hagen, Universitatea din Ottawa (Ottawa, Canada).

analize statistice

Datele au fost analizate folosind ANOVA corectate pentru măsuri repetate (atunci când este necesar). Analiza Scheffe a fost utilizată pentru a testa semnificația efectelor post-hoc. Analiza de regresie cu comparații de pantă a fost utilizată pentru a testa efectele întreruperii colchicinei asupra relației dintre leptina circulantă și masa grasă. StatView (SAS Institute, Inc., Carey, NC) a fost pachetul statistic comercial utilizat pentru toate analizele.

Rezultate

Controlează animalele

Anterior am arătat că vehiculul injectat în cele patru grupuri de celule hipotalamice nu afectează echilibrul energetic la șobolani (19); prin urmare, în aceste experimente am planificat să combinăm toți șobolanii cu injecțiile vehiculului într-un singur grup de control de referință. Injecțiile cu soluție salină în cele patru nuclee hipotalamice (n = 8/grupul celular; patru soluții saline date și patru leptină administrate cu icv în ziua 1) nu au provocat efecte specifice site-ului, iar rezultatele au fost combinate (Fig. 3). În comparație cu injecțiile cu soluție salină cu icv, leptina cu icv a determinat o scădere atât a creșterii în greutate corporală (cu ANOVA, P 20).

Efectele intervenției chirurgicale (ziua 0) și icv leptina (simboluri negre și bare) sau soluție salină (simboluri deschise și bare) în ziua 1 la șobolani injectați cu soluție salină în fiecare dintre cele patru grupuri de celule hipotalamice mediale (nu au existat diferențe statistice între rezultatele din șobolanii injectați cu soluție salină în cele patru regiuni și, prin urmare, datele au fost reunite pentru analize statistice; n = 16/grup). Rezultatele reprezintă media ± sem. *, Cel puțin P 39) și exprimat ca procent din UCP la șobolani injectați cu soluție salină icv.

Efectele intervenției chirurgicale (ziua 0) și icv leptina (simboluri negre și bare) sau ser fiziologic (simboluri deschise și bare) în ziua 1 la șobolani injectați cu soluție salină în fiecare dintre cele patru grupuri de celule hipotalamice mediale (nu au existat diferențe statistice între rezultatele șobolanii injectați cu soluție salină în cele patru regiuni și, prin urmare, datele au fost reunite pentru analize statistice; n = 16/grup). Rezultatele reprezintă media ± sem. *, Cel puțin P 39) și exprimat ca procent din UCP la șobolani injectați cu soluție salină icv.

Animale lezate

Regresia leptinei plasmatice pe masa mezenterică WAT (mWAT) la șobolani leziși cu colchicină în cele patru grupuri de celule hipotalamice mediale. Pentru comparație, linia de regresie găsită la șobolanii cu leziuni simulate (Fig. 6) este indicată de linia gri. Linia de regresie întreruptă în complotul ARC nu este o relație semnificativă; toate celelalte relații sunt extrem de semnificative. A se vedea textul pentru statistici.

Discuţie

La șobolanii cu leziuni simulate, greutatea corporală, aportul de alimente și eficiența calorică au fost scăzute acut și temporar după o injecție cu leptină cu icv și nu au existat efecte de durată asupra echilibrului energetic, deoarece greutățile depozitului de grăsimi și conținutul de iBAT UCP nu au fost modificate 4 zile după injecția cu leptină. Cu toate acestea, modelul diurn de hrănire demonstrează o schimbare izbitoare după injecția cu leptină cu icv, în care doar perioada de întuneric este redusă și hrana de lumină este nealterată în comparație cu cele la șobolanii injectați cu soluție salină. Acest rezultat confirmă constatările raportate de Hulsey și colab. (22), care au demonstrat că o injecție cu icv de leptină a modificat tiparele meselor prin scăderea selectivă a duratei mesei în timpul perioadei întunecate (nu a celei luminoase) fără a produce o aversiune gustativă condiționată. Este interesant faptul că șobolanii activi nocturn consumă majoritatea alimentelor în perioada întunecată, dar, în mod paradoxal, nivelurile plasmatice de leptină sunt, de asemenea, la vârf în timpul întunericului (23). Acest conflict aparent între secreția maximă de leptină și aportul maxim de alimente care apar la momente similare ale zilei sugerează că pot apărea decalaje importante între acțiunea leptinei asupra receptorilor săi și efectele ulterioare din aval.

Leziunile arcuate duc la pierderea activității neuronale NPY și POMC, iar leziunile paraventriculare duc la pierderea în acțiune a produselor NPY și POMC. Astfel, ambele leziuni ar trebui să producă efecte similare asupra consumului de alimente. În sprijinul acestei ipoteze, am raportat că micile tăieturi de cuțit plasate între ARC și PVN, care privează PVN de o anumită inervație de ARC, duc, de asemenea, la un aport crescut de alimente, atât în ​​perioadele luminoase, cât și în cele întunecate, similar cu efectele Leziuni ARC sau PVN (29). Mai mult, un procent semnificativ al varianței aportului alimentar la acești șobolani se explică prin relația inversă dintre aportul alimentar și cantitatea de αMSH (produs POMC) detectată în PVN prin colorare imunocitochimică (Bell, M. E., nepublicată). Rezultatele actuale, combinate cu efectele unei tăieturi a cuțitului PVN-ARC, sugerează că îndepărtarea unui aport tonic inhibitor din ARC către nucleele PVN duce la creșterea aportului de alimente, în conformitate cu efectele cauzatoare de obezitate ale eliminării receptorilor melanocortinei 4 (6).

Întreruperea PVN și ARC poate fi, de asemenea, diferențiată de modificările ulterioare ale relației leptină-insulină. Studiile noastre anterioare au demonstrat că întreruperea ARC a abolit relația normală dintre leptină și insulină, în timp ce panta relației a crescut după întreruperea PVN și DMN (19). Pare rezonabil să concluzionăm că receptorii de leptină ocupați din ARC reglează echilibrul energetic în PVN și în alte părți și că atunci când ieșirea axonală a celulelor care poartă acești receptori este blocată de colchicină, sistemul periferic de semnalizare a leptinei pe NPY (11, 32) - și Celulele de sintetizare POMC (10, 33) sunt dezactivate.

Studiile noastre, folosind volume mici de injecție de colchicină, fac distincție între mecanisme de hrănire și mecanisme metabolice care produc obezitate indusă de inhibarea nucleilor hipotalamici specifici. Studiile noastre anterioare au arătat că atât concentrația de colchicină, cât și volumul de injectat trebuie să fie mici pentru a limita efectele la un singur nucleu (15). Alții, folosind concentrații mai mari și volume mai mari de injecție de colchicină în VMN, nu au găsit selectivitatea marcată a aportului de alimente pe care am observat-o (34). Bănuim că volumul și concentrația mai mare de colchicină utilizate în aceste studii s-ar putea să se fi revărsat din VMN țintă și să fi blocat funcția în alte grupuri de celule, cum ar fi ARC.

Această lucrare a fost susținută parțial de Grant DK-28172, Grant DK-09519 (către S.C.), NIMH Grant 2-R25-MH-18910 (către R.S. și M.C.) și un grant de la American Diabetes Association.

Mulțumiri

Mulțumim lui Holly Ingraham, David Julius, David Pearce, Glenn Gobbel și John Fike pentru sugestii pe hârtie și lui Jean Himms-Hagen (Universitatea din Ottawa, Ottawa, Canada) pentru furnizarea generoasă de informații și reactivi pentru testul proteic de decuplare.