Heather R. Conti

1 Universitatea din Pittsburgh, Departamentul de Medicină, Divizia de Reumatologie și Imunologie Clinică, Pittsburgh, PA, Statele Unite ale Americii,

Natasha Whibley

1 Universitatea din Pittsburgh, Departamentul de Medicină, Divizia de Reumatologie și Imunologie Clinică, Pittsburgh, PA, Statele Unite ale Americii,

Bianca M. Coleman

1 Universitatea din Pittsburgh, Departamentul de Medicină, Divizia de Reumatologie și Imunologie Clinică, Pittsburgh, PA, Statele Unite ale Americii,

Abhishek V. Garg

1 Universitatea din Pittsburgh, Departamentul de Medicină, Divizia de Reumatologie și Imunologie Clinică, Pittsburgh, PA, Statele Unite ale Americii,

Jillian R. Jaycox

2 Universitatea Carnegie Mellon, Departamentul of Biological Sciences, Pittsburgh, PA, Statele Unite ale Americii,

Sarah L. Gaffen

1 Universitatea din Pittsburgh, Departamentul de Medicină, Divizia de Reumatologie și Imunologie Clinică, Pittsburgh, PA, Statele Unite ale Americii,

Conceput și proiectat experimentele: SLG HRC NW. Au efectuat experimentele: HRC NW BMC AVG JRJ. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: SLG HRC. Am scris lucrarea: HRC SLG.

Date asociate

Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Abstract

Introducere

Ciuperca comensală Candida albicans provoacă un spectru larg de patologii umane, variind de la infecții mucocutanate ușoare sau cronice la boli diseminate severe, adesea fatale. Colonizarea candidei la suprafețele mucoasei sau a pielii poate evolua spre candidoză în condiții de imunosupresie, perturbare a barierei sau utilizare cu antibiotice cu spectru larg [1, 2]. Boala diseminată cauzată de C. albicans este a patra cea mai frecventă infecție nosocomială și este asociată cu o rată de mortalitate de 20-80%. Pacienții cu HIV +/SIDA sunt deosebit de vulnerabili la candidoză orofaringiană (OPC, afte), indicând importanța specială a celulelor T CD4 + în protecția față de această formă de candidoză [3]. Candidoza mucocutanată cronică (CMC) este o infecție recurentă a pielii, mucoaselor și unghiilor (onicomicoză), frecvent observată la persoanele cu mutații care afectează celulele Th17, citokinele IL-17A și IL-17F sau receptorul lor IL-17RA. Bolile asociate cu CMC includ sindromul hiper-IgE (HIES, cunoscut și sub numele de sindromul lui Job) cauzat de mutații în STAT3 sau TYK2 sau sindromul de polendocrinopatie autoimună (APS-1), cauzat de mutații în AIRE sau în gene care au impact asupra IL-23./Axa de semnalizare IL-17, cum ar fi IL12B, STAT1, IL17RA, IL17F și ACT1 (revizuită în [4]).

În conformitate cu constatările la om, mai multe studii au demonstrat importanța căii IL-23/IL-17 în protecția candidozei la șoareci. Am arătat că șoarecii deficienți în IL-23-, IL-17RA-, IL-17RC- și Act1 sunt toți foarte sensibili la OPC [5-8]. Au fost descrise, de asemenea, roluri importante pentru axa de semnalizare IL-23/IL-17 în controlul candidozei dermice și diseminate la modelele de șoarece [9-11]. Colectiv, aceste studii indică faptul că șoarecele este un model fidel pentru înțelegerea naturii răspunsului imun la infecțiile cu Candida.

Terapiile biologice care vizează citokinele au demonstrat o eficacitate clinică considerabilă în tratarea artritei reumatoide, a psoriazisului, a bolii Crohn și a altor afecțiuni autoimune. În prezent există anticorpi monoclonali aprobați de FDA sau receptori solubili care blochează direct sau indirect axa Th17/IL-17, inclusiv agenți care neutralizează TNF-α, IL-1β, IL-6R și IL-12/23p40. Mai recent, studiile clinice de fază II și III care testează substanțe biologice care vizează în mod direct IL-17A sau IL-17RA au arătat o promisiune considerabilă în tratarea psoriazisului și sunt în curs de evaluare pentru o serie de alte afecțiuni reumatologice [12-16]. Având în vedere dovezile genetice acumulate conform cărora complexul IL-17RA/RC este esențial pentru protecția împotriva candidozei, este important să înțelegem efectele adverse potențiale ale terapiei anti-IL-17/IL-17RA asupra răspunsurilor imune care protejează împotriva infecțiilor oportuniste.

Materiale și metode

Candidoza orofaringiană

Șoarecii au fost pre-tamponați oral înainte de fiecare experiment pentru a verifica absența colonizării preexistente cu Candida. Șoarecii au fost inoculați sublingual timp de 75 de minute sub anestezie (ketamină 100 mg/kg și xilazină 10 mg/kg) Candida albicans (tulpina CAF2-1) plasată într-o minge de bumbac 0,0025 mg saturată sterilă, așa cum s-a descris anterior [6, 32]. Colegii de gunoi WT au fost folosiți ca un control negativ, deoarece se știe că elimină complet infecția până în ziua 5 după inoculare [6, 31]. La sfârșitul cursului de timp desemnat (4-5 d), limba a fost omogenizată folosind un disociator Miltenyi GentleMacs (Miltenyi Biotec). Diluțiile seriale au fost plăcute în triplicat pe plăci de agar YPD, incubate la 30 ° C timp de 48 de ore și unitățile formatoare de colonii (CFU) au fost enumerate pentru determinarea sarcinii fungice a țesutului. Șoarecii erau cântăriți zilnic. Șoarecii au fost sacrificați din motive umane dacă au pierdut mai mult de 25% în greutate sau au prezentat alte semne de durere sau suferință (cu toate acestea, în aceste experimente, niciun animal nu a intrat în această categorie). Fiecare punct reprezintă un mouse. Nu au existat evenimente adverse severe în niciun grup.

Candidoza diseminată

C. albicans (tulpina SC5314) a fost crescută peste noapte în YPD la 30 ° C cu agitare continuă. Șoarecii asemănători vârstei și sexului au fost injectați în vena cozii cu celule 1-2x105 C. albicans suspendate în 100 U PBS, așa cum este descris [31, 33]. Pentru injecții, șoarecii au fost ținuți pe scurt într-un aparat de reținere comercial (Braintree Scientific, Braintree MA). După 10 zile sau când pierderea în greutate a depășit 20% sau a prezentat alte semne de suferință, cum ar fi cocoșarea severă, tremuratul sau pierderea îndreptării, șoarecii au fost sacrificați uman prin inhalarea C02 urmată de luxația cervicală. Nu au existat evenimente adverse neașteptate în niciun grup. Țesutul renal a fost recoltat și omogenizat folosind tuburi C (Millipore) în 1 ml PBS. Omogenatele au fost diluate și placate pe agar YPD-AMP în triplicat și CFU enumerate pentru determinarea sarcinii fungice.

Candidoza cutanată

O suspensie de C. albicans (tulpina CAF2-1) a fost cultivată peste noapte în agar YPD cu agitare la 30 ° C. Cu două ore înainte de infecție, suspensia de C. albicans a fost diluată la 5x106 celule/ml și celulele au fost transferate în bulion YPD conținând 10% FBS și incubate cu agitare pentru a induce formarea hifalului. O conversie de 95% în hife a fost confirmată microscopic. Șoarecii au fost inoculați intradermic cu 50 ul de hife Candida în PBS așa cum s-a descris anterior (ref). Șoarecii au fost punctați de evaluatori orbi de cel puțin 3 ori pe săptămână pentru prezența sau absența completă a 4 parametri clinici: ulcerație, cruste, eritem și formarea nodulilor. Șoarecii au fost considerați negativi pentru vindecare dacă a fost prezent cel puțin un parametru. Nu au existat evenimente adverse severe în niciun grup.

PCR în timp real

ARN total a fost izolat folosind RNeasy Mini Kits (Qiagen). Sinteza ADNc a fost realizată folosind kituri Superscript III First Strand (Invitrogen, Carlsbad CA). Genele au fost măsurate prin transcriptază inversă în timp real PCR (qPCR) folosind SYBR Green FastMix ROX de la Quanta Biosciences (Gaithersburg, MD). Reacțiile PCR au fost efectuate pe un instrument 7300 Real Time PCR Systems (Applied Biosystems, CA). Expresia a fost normalizată la Gapdh. Primerii au fost din Super Array Biosciences sau QuantiTect Primer Assays (Qiagen).

Statistici

Datele au fost analizate de Kaplan-Meier, ANOVA, Mann-Whitney sau testul t al Studentului nepereche folosind GraphPad Prism (La Jolla, CA). Valorile P Fig 1A), ARNm care codifică IL-17C nu a fost detectabil la momentul inițial, dar a fost indus în mod semnificativ la 2 zile după infecție. ARNm Il17c a fost, de asemenea, crescut la șoarecii IL-17RA -/- supuși OPC, indicând faptul că expresia sa nu este în aval de semnalizarea IL-17R. Această constatare este în concordanță cu rezultatele publicate care arată că ARNm Il17a este, de asemenea, puternic indus la 2 zile după OPC [5, 35].

semnalizarea

A. Șoarecii WT și IL-17RA -/- (n = 3 per grup) au fost supuși nivelurilor de transcripție OPC și IL-17C evaluate prin qPCR. * p -/- Sham, n = 2; IL-17RE -/- Sham, n = 2; Infectat: IL-17C +/+ n = 9; IL-17RE +/+, n = 6; IL-17C -/-, n = 9; IL-17RE -/-, n = 6; IL-17RA -/- n = 7). Limba a fost recoltată în ziua 5 și CFU a fost enumerată 48 de ore mai târziu prin placarea diluțiilor seriale pe agar YPD. Date prezentate ca medie geometrică a CFU. Fiecare punct de date reprezintă un șoarece, iar graficul prezintă date grupate din două experimente independente (n = 2 pentru fiecare cohortă infectată cu fals și n≥6 total pentru fiecare cohortă infectată cu Candida). * Șoarecii p -/- și IL-17RE -/- au fost supuși OPC și încărcătura fungică orală a fost evaluată după 5 zile. La fel ca oamenii sănătoși, șoarecii WT sunt capabili să elimine complet infecția în 5 zile de la expunerea la C. albicans. Deși imunosupresia cu corticosteroizi este adesea utilizată ca control pozitiv în acest model de OPC, am folosit în schimb șoareci IL-17RA -/- ca martori (fără imunosupresie suplimentară), deoarece acești șoareci sunt reproductibili susceptibili la boli, judecat atât prin sarcina fungică, cât și prin scădere progresivă în greutate [6, 8]. Într-adevăr, după cum am văzut în numeroase studii anterioare, șoarecii la 5 zile după infecție IL-17RA -/- au prezentat o povară fungică ridicată (

1x10 4 CFU/g țesut) și a arătat o pierdere în greutate de 20%, validând importanța semnalizării IL-17RA în protecția împotriva OPC [6, 8] (Fig. (Fig1B 1B și and1C). 1C). În schimb, șoarecii IL-17C -/- și IL-17RE -/- au eliminat complet infecția până în ziua 5, fără nicio povară fungică detectabilă în limbă (Fig. 1B). Mai mult, șoarecii IL-17C -/- și IL-17RE -/- și-au recăpătat complet greutatea după o pierdere de greutate tranzitorie din cauza procedurii de infecție, într-un model identic cu șoarecii WT (Fig. 1C și datele nu sunt prezentate). Prin urmare, în timp ce șoarecii IL-17RA -/- au fost foarte sensibili la OPC, șoarecii cu deficit de IL-17C și IL-17RE au fost pe deplin rezistenți.

Un răspuns puternic la neutrofile și producerea de proteine ​​antimicrobiene protejează șoarecii imunocompetenți de infecția cu C. albicans [1, 6, 36, 37]. Am identificat anterior un grup de gene de semnătură dependente de IL-17RA care sunt induse după expunerea la C. albicans care reprezintă răspunsul transcripțional general la infecție [6]. Majoritatea acestor gene sunt reglementate de semnalizarea IL-17RA, inclusiv Lcn2 (codificând lipocalina-2, cunoscută și sub numele de 24p3) și Defb3 (codificând β-defensina 3, cunoscută și sub numele de BD3), o peptidă antimicrobiană cu activitate directă anti-Candida [ 38, 39]. În concordanță cu rezistența lor la infecție, controalele WT, șoarecii IL-17C -/- și IL-17RE -/- au prezentat toate profiluri genetice similare după inoculare, iar gene reprezentative precum Defb3 și Lcn2 au fost puternic induse în fiecare cohortă (Fig 1D ). În schimb, aceste transcrieri au fost detectate la niveluri semnificativ mai scăzute la șoareci IL-17RA -/- (Fig. 1D), în concordanță cu constatările noastre anterioare [6, 35]. În concluzie, aceste date indică faptul că, în timp ce semnalizarea IL-17A/IL-17RA este esențială pentru protecția OPC, semnalizarea IL-17C/IL-17RE pare a fi dispensabilă.

Șoarecii cu deficit de IL-17C și IL-17RE sunt rezistenți la candidoză diseminată

A-C. Controalele IL-17RE -/- și IL-17RE +/+ au fost supuse candidozei sistemice prin injectarea venei cozii de 2x10 5 C. albicans tulpina SC5314 (IL-17RE +/+ n = 11; IL-17RE -/-, n = 13; IL-17C +/+; n = 10; IL-17C -/- n = 11). Șoarecii au fost evaluați zilnic și este prezentat timpul de sacrificiu. ns., nu semnificativ. Datele sunt reprezentative pentru 2 experimente independente. CD. Șoarecii IL-17RE -/- (n = 7) și șoarecii IL-17C -/- (n = 5) au fost injectați cu 1x10 5 celule C. albicans ca în panoul A. Colegii de așternut WT (IL-17C +/+, n = 4 și IL-17RE +/+, n = 5) și IL-17RA -/- șoareci (n = 5) au servit drept controale. ns., nu semnificativ. Datele sunt reprezentative pentru un experiment independent. E. Evaluările schimbării greutății au fost făcute în toate cohortele după infecția cu 2x105 celule C. albicans și prezentate ca procent din greutatea inițială. F. Rinichii au fost recoltați din fiecare cohortă în ziua 2 după infecția sisteică și s-au efectuat pentru genele indicate. * p +/+ Sham, n = 3; IL-17RE -/- Sham, n = 2; IL-17RE +/+ n = 9; IL-17RE -/- n = 10). Sunt prezentate datele grupate din două experimente independente.

Semnalizarea IL-17C și IL-17RE nu este necesară pentru rezolvarea candidozei cutanate

A. Șoarecii indicați au fost supuși candidozei dermice prin injecție subcutanată cu hifele de tulpină C. albicans CAF2-1 (IL-17RE +/+ Sham, n = 6; Infecți: IL-17RC -/-, n = 5; C57BL/6 WT, n = 4; IL-17RE +/+, n = 21; IL-17RE -/-, n = 19). Se prezintă procentul de șoareci pozitivi pentru leziuni în timp. * șoareci p -/- și IL-17RC -/- în zilele 4 și 6. Datele sunt reprezentative pentru două experimente independente.

Discuţie

IL-17A a intrat în evidență odată cu descoperirea subpopulației Th17 de celule T [42]. Lucrările ulterioare din grupul nostru și alții au arătat că subunitatea IL-17RA este esențială pentru imunitatea la diferite forme de candidoză, nu numai la modelele experimentale de șoareci, ci și la oameni cu predispoziții genetice la CMC [6, 10, 11, 43]. Un rol similar în imunitatea anti-Candida a fost găsit pentru IL-17RC, co-receptor obligatoriu pentru semnalizarea mediată de IL-17A [8, 19]. Comparațiile IL-17A și IL-17F indică, în general, că IL-17A este mai puternică decât IL-17F în medierea imunității la candidoză, deși această problemă nu este încă complet definită [40, 44]. Deși importanța IL-17RA/RC a fost clară, IL-17RA este utilizată de alți liganzi, inclusiv IL-17C, lăsând deschisă posibilitatea ca citokinele pe lângă IL-17A să contribuie la imunitatea la candidoză.

În acest studiu, am folosit cele mai larg acceptate modele de candidoză orală, cutanată și cutanată, niciuna dintre care nu a dezvăluit un rol pentru IL-17C sau IL-17RE în apărarea gazdei. Cu toate acestea, există alte variații ale acestor modele care utilizează alte tulpini de Candida albicans, medii genetice sau căi ușor diferite de administrare a Candidei, unde este posibil să se poată observa un rol pentru IL-17C/IL-17RE. În mod similar, poate exista un rol pentru semnalizarea IL-17C/IL-17RE în alte tipuri de infecții fungice. Rolul IL-17 în candidoză vaginală este controversat, dar unele dovezi sugerează că celulele Th17 pot contribui la imunitate la acest sit [47, 48]. În mod clar, studiile viitoare pentru a defini activitățile biologice ale semnalizării IL-17C în candidoză vaginală sunt justificate.