Acidul betulinic (BA) crește fosforilarea oxidului nitric sintetic endotelial (eNOS) la reziduul Ser 1177 într-o manieră dependentă de concentrație. Celulele endoteliale EA.hy 926 umane au fost tratate cu 1, 3, 10 30 sau 100 uM de BA timp de 30 de minute sau DMSO cu solvent de control. (A) Analiza Western blot a fost efectuată folosind un anticorp fosfo-specific și un anticorp eNOS total. ENOS total și β-tubulină au fost utilizate pentru normalizare. Coloanele reprezintă media aritmetică și deviația standard. * p n = 9; (B) prezintă pete reprezentative.

estrogen

Modelul Emax al creșterii procentuale a fosforilării eNOS induse de acidul betulinic la reziduul Ser 1177. O ecuație Hill cu o eficacitate maximă (Emax) de 85,9 și o concentrație efectivă jumătate maximă (EC50) de 0,57 µM și un factor de formă de 0,7374 este cea mai potrivită pentru datele experimentale.

Acidul betulinic (BA) crește fosforilarea eNOS la reziduul Ser 1177 sau într-o manieră dependentă de timp. Celule endoteliale EA.hy 926 umane au fost tratate cu 30 uM BA timp de 15, 30 și 60 min. Controalele (C) au fost incubate cu 1 (DMSO. (A) Analiza Western blot a fost efectuată cu un anticorp fosfo-specific și un anticorp eNOS total. ENOS total și β-tubulină au fost utilizate pentru normalizare. Coloanele reprezintă media arthmetică și deviația standard. * p n = 9; (B) prezintă pete reprezentative.

Fosforilarea eNOS indusă de acidul betulinic (BA) la reziduul Ser 1177 implică receptorul de estrogen și calea PI3K. Celulele endoteliale EA.hy 926 umane au fost pre-incubate timp de 60 de minute cu antagonistul receptorului de estrogen ICI 182.780 (10 µM; panou (A)), sau cu inhibitori ai fosfoinozidei 3-kinazei (PI3K) LY294002 (10 µM; panou (B )) și wortmannin (1 uM, panou (C)). Apoi, 30 uM BA au fost adăugați la celule și au fost incubați pentru încă 60 min. Analizele Western blot au fost efectuate cu un anticorp eNOS-Ser 1177 fosfo-specific și un anticorp eNOS total. ENOS total și β-tubulină au fost utilizate pentru normalizare. Coloanele reprezintă media aritmetică și deviația standard. * p n = 9.

Acidul betulinic (BA) stimulează producerea de oxid nitric (NO) de celule EA.hy 926. Celulele endoteliale EA.hy 926 umane au fost pre-incubate cu 1 uM wortmannin, 10 uM LY294002, 10 uM ICI 182.780 sau 1 ‰ DMSO (martori) timp de 60 min. Apoi, s-au adăugat 30 µM BA sau DMSO și celulele au fost incubate pentru încă 60 min. NO-ul bioactiv din aceste celule a fost cuantificat utilizând celule raportoare RFL-6 bogate în guanilil ciclază. Controalele pozitive au fost stimulate cu SIN-1 pentru producția maximă de cGMP. Conținutul de guanozin monofosfat ciclic (cGMP) al celulelor RFL-6 reflectă producția de NO și a fost măsurat cu un test radioimuno. Coloanele reprezintă media aritmetică și deviația standard. * p n = 9.

Efectele acidului betulinic (BA) asupra apoptozei. Celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC, (A)) și linia celulară de carcinom epitelial alveolar A549/8 (B) au fost tratate cu BA sau staurosporină (St, 100 nM) ca martor pozitiv, timp de 18 ore. Activitatea caspasei-3/7 a fost măsurată cu testul luminiscent Caspase-Glo® 3/7 (Promega Corporation, Madison, WI, SUA). Coloanele reprezintă media și eroarea standard a mediei. *** p n = 12.

Căi de semnalizare propuse pentru activarea eNOS indusă de acidul betulinic (BA) prin fosforilarea reziduului Ser 1177 în celulele EA.hy 926. Fosforilarea eNOS Ser 1177 indusă de BA și formarea NO sunt prevenite de antagonistul receptorului de estrogen (ER) ICI 182.780 sau de inhibarea farmacologică a căii fosfatidil-inozitol-3-kinazei (PI3K)/Akt cu wortmannin sau LY294002. În plus, un studiu anterior [41] a demonstrat implicarea canalelor de calciu de tip l (LTCC), receptorilor ryanodinei (RyR), calmodulinei (CaM), kinazei II dependente de calcodulină calcică (CaMKII), protein kinazei kinazei CaMKK dependente de calmodulină calcică ) și proteina kinază activată cu AMP (AMPK).

Abstract

1. Introducere

2. Rezultate

3. Discuție

Creșterea de 2 ori a activității enzimei. Nu poate explica explozia producției de NO observată după activarea celulelor endoteliale de către agoniștii care cresc calciul [42].