Abstract

Introducere

Prevalența mondială a diabetului crește într-un ritm rapid, iar în rândul populației cu diabet zaharat, diabetul de tip 2 reprezintă aproximativ 90% din toate cazurile din întreaga lume. Inactivitatea fizică, aportul de grăsimi trans și obezitate sunt considerate drept principalul factor care contribuie la creșterea diabetului (1,2). Creșterea rapidă a incidenței diabetului crește, de asemenea, povara globală a complicațiilor diabetice, inclusiv pierderea vederii datorată retinopatiei diabetice (3), iar modelele experimentale sunt cheia înțelegerii mecanismelor moleculare pentru intervențiile terapeutice.

într-un

Mediul diabetic crește stresul oxidativ și se consideră că stresul oxidativ joacă un rol major în dezvoltarea retinopatiei diabetice (12-14). În diabet, mitocondriile retiniene sunt deteriorate, iar deteriorarea ADN-ului este mai extinsă în regiunea buclei de deplasare (D-Loop) a ADNmt, regiunile importante pentru transcrierea și replicarea ADNmt. Mai mult, expresia multor gene retiniene și proteine ​​asociate cu homeostazia mitocondrială este modificată (14,15). Modele experimentale au documentat că creșterea speciilor de oxigen reactiv citosolic (ROS) precede disfuncția mitocondrială (16), iar NADPH oxidaza 2 (Nox2) este una dintre enzimele majore asociate cu producția de ROS citosolică. Rac1, o proteină G cu greutate moleculară mică, este o componentă obligatorie a holoenzimei Nox2, iar în retinopatia diabetică, semnalizarea Rac1-Nox2-ROS este activată înainte de afectarea mitocondrială (17).

Cercetări recente au documentat că mecanismul enzimatic responsabil de modificările epigenetice, modificările care pot modifica expresia genelor fără a afecta secvența ADN, este, de asemenea, modificat în diabet (14,15,18). Enzimele responsabile de menținerea stării de metilare a ADN, ADN metil transferazele (Dnmts) și zece-unsprezece translocații metilcitozino dioxigenazele (Tets), sunt activate, iar ADNmt este hipermetilat în retină și vasculatura sa la rozătoarele diabetice de tip 1 și la donatorii umani cu retinopatie diabetică documentată (19). Cu toate acestea, nu este clar modul în care obezitatea/hiperlipidemia afectează metilarea ADN și mecanismele sale enzimatice în mediul hiperglicemic.

Un model de șobolan hiperglicemic indus cu conținut ridicat de grăsimi/streptozotocină (Stz) este utilizat acum pentru complicații neuronale și screening farmacologic (20,21), dar dezvoltarea retinopatiei diabetice în acest model animal nu este elucidată. Scopul nostru a fost investigarea dezvoltării retinopatiei diabetice la acest model animal diabetic de tip 2, care imită progresia normală și caracteristicile metabolice ale diabetului de tip 2 uman. Am investigat patologia vasculară a retinei și modificările funcționale într-un model de șobolan alimentat cu conținut ridicat de grăsimi de la 2 la 6 luni după hiperglicemia indusă de Stz și am comparat-o cu un model de șobolan diabetic de tip 1. Pentru a înțelege mecanismul molecular, leziunile mitocondriale și modificările epigenetice ale ADNmt și ale promotorului Rac1 sunt evaluate în microvasculatura retiniană din aceste modele animale diabetice.

Proiectare și metode de cercetare

Șobolanii masculi Sprague Dawley (în vârstă de 9 până la 10 săptămâni) au fost împărțiți în două grupuri; în timp ce șobolanii din grupa 1 au rămas pe șobolanul obișnuit (numărul de catalog 7001; Envigo, Indianapolis, IN) conținând 4,25% kcal ca grăsime, șobolanii din grupa 2 au fost plasați pe o dietă bogată în grăsimi (numărul de catalog D12451; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ) conținând 45% kcal ca grăsime. După 8 săptămâni la o dietă bogată în grăsimi, jumătate din șobolani au primit o doză mică de Stz (30 mg/kg greutate corporală [BW] i.p.) pentru a induce diabetul (T2D) (21,22). În același timp, jumătate din șobolani pe șobolanii obișnuiți (grupa 1) au fost, de asemenea, injectați cu 60 mg/kg BW Stz (T1D) (16), iar cealaltă jumătate au rămas martori normali (Norm); fiecare grup avea 12-16 șobolani. Șobolanii din grupurile T2D și HF au fost menținuți pe aceeași dietă bogată în grăsimi și grupurile T1D și Norm pe chow de șobolan normal pe tot parcursul experimentului. Au fost sacrificați la 2, 4 și 6 luni după administrarea Stz. Tratamentul animalelor a fost în conformitate cu liniile directoare ale Declarației Asociației pentru Cercetare în Viziune și Oftalmologie pentru utilizarea animalelor în cercetarea oftalmică și vizuală și a urmat liniile directoare instituționale.

Toleranță la glucoză și rezistență la insulină

Șobolanii au fost postiti peste noapte, au fost cantariti si li s-a administrat glucoza (2 g/kg iW p.p.). Glucoza din sânge a fost măsurată folosind benzi de reactiv glucoză-oxidază chiar înainte și 15–180 min după administrarea glucozei (22).

Sensibilitatea la rezistența la insulină a fost determinată prin administrarea de Humulin R (1 UI/kg iW p.p.) (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN) și măsurarea glicemiei lor 0-180 min după administrarea insulinei (23).

Profilul lipidic seric

Colesterolul seric și trigliceridele au fost cuantificate folosind truse comerciale de la Abcam (numere de catalog ab65390 și ab65336; Cambridge, MA), așa cum s-a descris anterior (8).

Microvasele retiniene

Retina a fost suspendată în 15-20 ml de apă deionizată și incubată într-o baie de apă cu agitator timp de 1 oră la 37 ° C. După îndepărtarea țesutului necapilar prin inspirație și ejectare repetate, preparatul a fost clătit cu PBS steril (24,25). Fiecare preparat de microvasel a inclus retină din grupurile Norm, T1D, T2D și HF.

Histopatologie microvasculară

Întreaga retină a fost izolată de ochii fixați în formalină și, după ce a clătit peste noapte în apă curentă, a fost incubată 45-70 min la 37 ° C în 3% tripsină brută (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY) conținând 200 mol/L Fluorură de sodiu. Vasculatura curățată a fost colorată cu hematoxilină periodică acidă Schiff (PAS) (numărul de catalog 395B; Sigma-Aldrich), iar capilarele celulare și fantomele pericite au fost numărate la microscop (8,26).

Electroretinogramă

Electroretinograma (ERG) a fost efectuată la șobolani adaptați la întuneric anesteziați cu ketamină-xilazină. Pupila a fost dilatată cu soluție oftalmică de tropicamidă și, după lubrifierea corneei cu Goniovisc, răspunsurile ERG au fost măsurate folosind Ocuscience HMsERG. S-au folosit flash-uri Ganzfeld cu intensități cuprinse între 100 și 25.000 mcd.s/m 2, iar răspunsurile ERG au fost înregistrate. Amplitudinile și timpul implicit al undei b au fost măsurate utilizând software-ul ERGView (8,26).

Expresia genelor

ARN, izolat din microvase folosind reactiv TRIzol, a fost utilizat pentru a sintetiza ADNc. Transcrierile genetice au fost estimate prin PCR cantitativă pe bază de SYBR Green (qPCR) folosind primeri specifici genei (Tabelul suplimentar 1). β-Actina a fost utilizată ca genă de menaj, iar modificarea ori a fost calculată utilizând metoda ciclului de prag ΔΔ.

Daune mtDNA și numerele de copiere

Pentru deteriorarea ADNmt, regiunile lungi (13,4-kb) și scurte (210-bp) ale ADNmt au fost amplificate în ADN-ul genomic obținut din microvase retiniene utilizând PCR semicantitativă, iar produsele au fost rezolvate pe un gel de agaroză 2%. Amplificarea relativă a fost cuantificată prin normalizarea intensității produsului lung cu produsul scurt (17).

Numărul de copii mitocondriale a fost determinat în ADN-ul genomic prin cuantificarea raportului dintre gena codificată mtDNA citocromul B (CytB) și ADN-ul nuclear codificat β-actină (27).

Nivelurile totale de ROS au fost măsurate în microvase retiniene (4 până la 5 μg proteine) fluorimetric folosind diacetat de 2 ′, 7′-diclorofluorescină (număr de catalog D6883; Sigma-Aldrich) (8).

Activitatea Rac1

Setul de testare colorimetrică G-LISA (număr de catalog BK-128; Cytoskeleton, Inc., Denver, CO) a fost utilizat pentru a cuantifica activitatea Rac1 în 20-25 μg proteină (8,28). Valorile din grupul Norm au fost considerate 1.

Metilarea ADN-ului

5-Metilcitozina (5mC) la D-Loop și 5-hidroximetilcitozina (5hmC) la promotorul Rac1 au fost cuantificate în ADN-ul genomic imunoprecipitat folosind kituri EpiQuik de imunoprecipitare ADN metilat și hidroximetilat (numere de catalog P-1015 și, respectiv, P-1038, din EpiGentek, Farmingdale, NY), după cum sa descris anterior (19.24).

Legarea Tet2, Dnmt1 sau a factorului de transcripție a factorului nuclear-κB (NF-κB) (subunitatea p65) la promotorul Rac1 a fost determinată prin testul de imunoprecipitare a cromatinei (19,24) folosind IgG ca control al anticorpilor. Anticorpii utilizați pentru imunoprecipitare - Tet2 (numărul de catalog ab135087), Dnmt1 (numărul de catalog ab13537), p65 (numărul de catalog ab7970) și IgG (numărul de catalog ab171780) - au fost obținuți de la Abcam.

Activitatea Tets

Trusa de testare a activității/inhibiției TET EpiQuik Epigenase 5mC-Hydroxylase (număr de catalog P-3087; EpiGentek) a fost utilizată pentru a determina activitatea Tets în fracțiunea nucleară retiniană (15-20 μg proteină), așa cum a fost descris anterior (19).

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. Comparația între grupuri a fost făcută folosind ANOVA unidirecțional, urmată de testul Dunn t; P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Parametrii metabolici

Toleranță la glucoză înainte și după inducerea diabetului. Toleranța la glucoză a fost evaluată la șobolani ținute peste noapte menținuți pe dieta normală sau bogată în grăsimi înainte de (A) și 2, 4 și 6 luni după administrarea (B - D) Stz. E: Sensibilitatea la rezistența la insulină a fost evaluată prin măsurarea glucozei la șobolani după administrarea Humulin R (1 UI/kg BW). Fiecare grafic este reprezentativ pentru 7-9 șobolani din fiecare grup.

În timp ce grupurile T1D, HF și Norm au avut un număr similar de capilare acelulare și fantome pericite la o durată de 4 luni, acestea au fost semnificativ mai mari în grupul T2D. Cu toate acestea, la 6 luni de diabet, histopatologia a fost comparabilă în grupurile T1D și T2D, cu un număr similar de capilare acelulare și fantome pericite în vasculatura retiniană (Fig. 2A și B). Figura 2C și D reprezintă microvasculatura retiniană digerată cu tripsină colorată cu PAS de la șobolani la 4 și respectiv 6 luni de diabet.

O limitare a acestui studiu este utilizarea doar a șobolanilor masculi și nu poate fi exclusă posibilitatea ca în condiții experimentale similare șobolanii femele să nu dezvolte retinopatie sau severitatea hiperglicemiei/hiperlipidemiei și a retinopatiei poate fi mai mare decât cea observată la șobolanii masculi. . Mai mult, mecanismul dezvoltării retinopatiei diabetice la șobolanii femele poate fi diferit de cel propus în acest studiu pentru șobolanii masculi; viitoarele studii se vor concentra pe abordarea variațiilor bazate pe sex în acest nou model animal diabetic de tip 2 al retinopatiei.

Obezitatea este considerată un factor de risc puternic al diabetului de tip 2 și, în acest studiu, am demonstrat în mod clar dezvoltarea retinopatiei într-un model animal în care obezitatea este urmată de hiperglicemie, imitând îndeaproape populația generală de pacienți cu diabet de tip 2. Modificările epigenetice sunt puternic influențate de factori externi, inclusiv exerciții fizice și dietă, și arătăm că obezitatea/hiperlipidemia mărește în continuare modificările epigenetice ale ADN mt și promotor Rac1, accelerând afectarea mitocondrială și dezvoltarea retinopatiei diabetice. Astfel, strategiile axate pe menținerea unui stil de viață bun și a IMC, pe lângă ameliorarea hiperlipidemiei, ar putea fi, de asemenea, benefice în reglarea modificărilor epigenetice și prevenirea/întârzierea retinopatiei la pacienții cu diabet zaharat.

Informații despre articol

Mulțumiri. Autorul îi mulțumește Dr. Duraisamy și Dr. Sunita (Wayne State University) pentru ajutor cu experimentele inițiale și Dr. Mohammad și Gina Polsinelli (Wayne State University) pentru analiza histologiei și, respectiv, a ajutorului tehnic.

Finanțarea. Acest studiu a fost susținut în parte de subvenții de la National Eye Institute (EY014370, EY017313 și EY022230) și Fundația Thomas către R.A.K. și o subvenție nerestricționată din partea Cercetării pentru prevenirea orbirii către Departamentul de Oftalmologie, Universitatea de Stat Wayne.

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.