Departamentul de Biologie pentru Afiliere, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, Statele Unite ale Americii

pdzk1

Departamentul de afiliere pentru patologie și Centrul de cercetare a biologiei vasculare, Centrul Medical Beth Israel-Deaconess și Școala de Medicină Harvard, Boston, Massachusetts, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru patologie și Centrul de cercetare a biologiei vasculare, Centrul Medical Beth Israel-Deaconess și Școala de Medicină Harvard, Boston, Massachusetts, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Biologie pentru Afiliere, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru patologie și Centrul de cercetare a biologiei vasculare, Centrul Medical Beth Israel-Deaconess și Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, Statele Unite ale Americii

  • Ayce Yesilaltay,
  • Kathleen Daniels,
  • Rinku Pal,
  • Monty Krieger,
  • Olivier Kocher

Cifre

Abstract

fundal

PDZK1 este un domeniu cu patru PDZ care conține proteine ​​care se leagă de capătul carboxi al receptorului HDL, receptorul scavenger clasa B tip I (SR-BI) și reglează expresia, localizarea și funcționarea acestuia într-un mod specific țesutului. Șoarecii knockout PDZK1 (KO) se caracterizează printr-o reducere marcată a expresiei proteinei SR-BI (~ 95%) în ficat (reducere mai mică sau deloc în alte organe), cu o creștere concomitentă de 1,7 ori a colesterolului plasmatic. PDZK1 s-a dovedit a fi ateroprotector folosind modelul de ateroscleroză murină apolipoproteină E (apoE) murină alimentată cu diete bogate în grăsimi/colesterol ridicat („occidental”), probabil din cauza rolului său în promovarea transportului invers al colesterolului prin SR-BI.

Principalele constatări

Aici, am examinat efectele deficitului de PDZK1 la șoarecii apoE KO hrăniți cu dieta aterogenă „Paigen” timp de trei luni. Comparativ cu apoE KO, șoarecii PDZK1/apoE dublu KO (dKO) au prezentat creșterea lipidelor plasmatice (creștere cu 33% a colesterolului total; creștere cu 49% a colesterolului neesterificat; și creștere cu 36% a fosfolipidelor) și o creștere cu 26% a leziunilor rădăcinii aortice. În comparație cu apoE KO, șoarecii dKO au prezentat o boală coronariană ocluzivă substanțială: o creștere de 375% a ocluziilor severe. Infarctele miocardice, care nu au fost observate la șoarecii apoE KO (deși s-a observat ocazională fibroză minimă), au fost observate la 7 din 8 șoareci dKO, rezultând o zonă de fibroză de 12 ori mai mare la mușchiul cardiac dKO.

Concluzii

Aceste rezultate arată că șoarecii PDZK1/apoE dKO hrăniți cu dietă Paigen reprezintă un nou model animal util pentru studierea bolilor coronariene și sugerează că PDZK1 poate reprezenta o țintă valoroasă pentru intervenția terapeutică.

Citare: Yesilaltay A, Daniels K, Pal R, Krieger M, Kocher O (2009) Pierderea PDZK1 cauzează ocluzia arterei coronare și infarctul miocardic la șoarecii cu deficiență de apolipoproteină E alimentată de dietă Paigen. PLOS ONE 4 (12): e8103. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008103

Editor: Annarosa Larry, Harvard Medical School, Statele Unite ale Americii

Primit: 19 august 2009; Admis: 5 noiembrie 2009; Publicat: 1 decembrie 2009

Finanțarea: Susținut de subvenții de la Institutele Naționale de Sănătate HL-52212 și HL66105 (MK), HL077780 (OK). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Hipercolesterolemia este recunoscută ca fiind unul dintre cei mai importanți factori de risc predispozanți pentru dezvoltarea aterosclerozei coronare ocluzive și a infarctului miocardic [1]. În condiții experimentale tipice, nici receptorii LDL, nici șoarecii apoE KO nu prezintă boală coronariană ocluzivă robustă asociată cu infarct miocardic, disfuncție cardiacă și deces în primele șase luni de viață (vezi de exemplu [2]). După vârsta de 8 luni (dietă chow) [3] sau 5 luni (dietă occidentală) [4], șoarecii apoE KO dezvoltă leziuni aterosclerotice în segmentele proximale ale arterelor coronare, rezultând probabil din extinderea leziunilor prezente în rădăcina aortică [ 4]. Fibroză miocardică ocazională a fost observată la șoareci apoE KO în vârstă de 10 luni [4]. În schimb, există o rădăcină robustă aortică și ateroscleroză aortică la acești șoareci și sunt utilizați în mod obișnuit ca model de ateroscleroză umană [5], [6], [7].

Lipoproteinele de înaltă densitate (HDL) și receptorul său, receptorul scavenger clasa B tip I (SR-BI), au fost descrise ca ateroprotectoare [8], [9], [10], [11], [12]. Participă la transportul colesterolului din țesuturile periferice (de exemplu, plăci ateromatoase) la ficat și excreția ulterioară în bilă, un proces numit transport invers al colesterolului [13], [14], [15]. SR-BI este o proteină asociată membranei de 509 aminoacizi, exprimată predominant în ficat și organe steroidogene, precum și în enterocite din intestinul subțire, macrofage și celule endoteliale [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21].

Mai multe modele experimentale au arătat că supraexprimarea SR-BI în ficatul murin scade gradul de ateroscleroză, chiar dacă scade concentrația de colesterol HDL-plasmatic [22], [23], [24], [25]. Pierderea parțială sau totală a SR-BI crește ateroscleroza la mai multe modele murine [12], [26], [27], [28].

Șoarecii deficienți atât în ​​SR-BI cât și în apolipoproteină E (șoareci SR-BI/apoE double knockout (dKO)) hrăniți cu o dietă normală de chow nu numai că prezintă hipercolesterolemie accentuată dramatic și ateroscleroză rădăcină aortică accelerată [12], dar prezintă, de asemenea, debut coronarian ocluziv rapid ateroscleroza arterei, infarctul miocardic și moartea prematură (vârsta medie a decesului ∼6 săptămâni) [11]. Astfel, șoarecii SR-BI/apoE dKO oferă un model animal foarte rapid, mic, care imită multe trăsături cardinale ale bolilor coronariene umane [2], [11], [29].

PDZK1 este o proteină din patru domenii PDZ care se leagă și reglează expresia SR-BI într-o manieră specifică țesutului [30], [31], [32], [33]. Pierderea PDZK1 la șoarecii PDZK1 KO este însoțită de o reducere de -95% a nivelurilor hepatice de SR-BI și o creștere concomitentă de -1,7 ori a nivelului plasmatic al colesterolului total. Cu toate acestea, pierderea PDZK1 nu afectează expresia SR-BI în țesuturile steroidogene [32] sau macrofage [21]. Aceste descoperiri au condus la concluzia că PDZK1 este o proteină adaptor tisulară specifică pentru SR-BI și se alătură ARH (gena hipercolesterolemiei recesive autozomale) într-o nouă clasă de proteine ​​adaptoare tisulare specifice pentru receptorii lipoproteinelor. ARH este un adaptor pentru receptorul LDL [34] care reglează acest receptor într-un mod specific țesutului.

Am arătat anterior că PDZK1 este ateroprotector la șoareci [21]. Șoarecii PDZK1/apoE dKO hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi/colesterol ridicat (dieta occidentală) dezvoltă ateroscleroză rădăcină aortică crescută comparativ cu șoarecii apoE unici KO, dar nu reușesc să dezvolte boala coronariană ocluzivă și infarctul miocardic [21].

În acest raport, am examinat efectele a 3 luni de hrănire cu o altă dietă aterogenă, dieta bogată în grăsimi, colesterol ridicat, conținând colatul „Paigen” pe șoarecii PDZK1/apoE dKO și controlul șoarecilor apoE single KO. Am constatat că dieta Paigen a indus o hipercolesterolemie mai severă și o ateroscleroză aortică mai mare la șoarecii PDZK1/apoE dKO decât la martorii apoE KO. În mod surprinzător, spre deosebire de dieta occidentală, dieta Paigen a indus dezvoltarea aterosclerozei arteriale coronare ocluzive și a infarctului miocardic la șoarecii PDZK1/apoE dKO care nu au fost observați în controalele apoE KO. Astfel, șoarecii PDZK1/apoE dKO hrăniți cu diete Paigen reprezintă un nou model murin al bolilor coronariene și sugerează că PDZK1 poate reprezenta o țintă valoroasă pentru intervenția terapeutică.

Materiale și metode

Protocoalele pentru animale au fost revizuite și aprobate de comitetele respective de îngrijire și utilizare a animalelor de la Centrul Medical Beth Israel Deaconess și Institutul de Tehnologie din Massachusetts.

Animale

Șoarecii deficienți ApoE (fundal C57BL/6) au fost achiziționați de la Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), împerecheați cu șoareci deficienți PDZK1 (fundal 129 SvEv) și încrucișați înapoi timp de 6 generații în fundal C57BL/6 pentru a genera dubla eliminare PDZK1/apoE (dKO) și apoE șoareci KO unici așa cum s-a descris anterior [21]. Ca rezultat, s-au efectuat experimente folosind șoareci masculi apoE KO și PDZK1/apoE dKO masculi cu un fond de ~ 98,5% C57BL/6/1,5% 129 SvEv. Genotipurile au fost determinate prin PCR folosind protocoalele stabilite ([35] și site-ul Jackson Laboratories). Pentru analize ale lipoproteinelor (n = 8-25 așa cum se arată în Tabelul 1) și aterosclerozei (n = 8 pe grup) și morfologie cardiacă (n = 8 pe grup), animalele de aproximativ 4 săptămâni au fost hrănite cu „Paigen dietă ”de la Harlan Teklad (Madison, WI) conținând 7,5% unt de cacao, 15,8% grăsimi, 1,25% colesterol, 0,5% colat de sodiu timp de 3 luni [36].

Analize morfologice și biochimice

Imunobloturile au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [40]. Pe scurt, eșantioanele totale de ficat (40-50 µg de proteină/probă) au fost fracționate în mărime cu 10% SDS-PAGE și imunoblotate pe membrane de nitroceluloză fie cu anticorpi antipeptidici policlonali pentru SR-BI [16], fie pentru actină (utilizată ca încărcare de proteine control, Sigma). Legarea anticorpilor de probele de proteine ​​a fost vizualizată prin chemiluminescență îmbunătățită folosind reactivi Super Signal West Pico Luminal (Pierce, Rockford, IL). Pentru a determina dacă dieta Paigen a indus modificări în expresia SR-BI hepatică, cantitățile relative de SR-BI au fost măsurate folosind un software Kodak Image Station 440 CF și software Kodak 1D în probe de ficat din apoE KO și PDZK1/apoE dKO șoareci hrăniți cu dieta Chow sau Paigen timp de trei luni (trei șoareci pe grup). Rezultatele au fost normalizate în ceea ce privește nivelul de exprimare a actinei în probele de țesut respective.

Studiile de imunoperoxidază pentru a determina contribuția respectivă a macrofagelor și a celulelor musculare netede în leziunile aterosclerotice ale rădăcinii aortice au fost efectuate folosind CD68 (Serotec) și anticorpi alfa actin ai mușchilor netezi (Thermo Scientific) conform recomandărilor producătorului. Secțiunile fixate congelate cu cinci fixări au fost colorate cu anticorpi anti-CD68 sau anti-actin ai mușchilor netezi, urmate de IgG biotinilate fie anti-șobolan sau anti-șoarece, vizualizate prin colorare imunoperoxidază și contracolorate cu hematoxilină modificată Harris, așa cum a fost descris anterior [32].

Colesterolul total și neesterificat, fosfolipidele și trigliceridele au fost măsurate folosind kituri (Wako Chemical, Richmond, VA). Fracționarea mărimii FPLC a lipoproteinelor plasmatice a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [41].

Analize statistice

O valoare a lui P Figura 1. Analiza imunoblot a expresiei hepatice SR-BI.

Șoarecii cu genotipurile indicate au fost hrăniți cu o dietă „Paigen” cu conținut ridicat de grăsimi/colesterol ridicat/colat timp de trei luni. Ficatele au fost recoltate și supuse imunoblotării folosind anticorpi anti-SR-BI și anti-actină (controlul încărcării) așa cum este descris în Materiale și metode.

Reducerea dramatică a SR-BI hepatică prin ablația genei PDZK1 la șoarecii apoE KO hrăniți cu dietă Paigen a fost însoțită de niveluri plasmatice crescute de colesterol total (33%), colesterol neesterificat (49%) și fosfolipide (36%) ca precum și o creștere a raportului colesterol neesterificat la total (14%) și a greutății corporale totale (13%) (Tabelul 1).

Figura 2 prezintă profilurile de distribuție a mărimii colesterolului în lipoproteinele plasmatice măsurate prin FPLC. După cum sa raportat anterior [3], [5], [6], cea mai mare parte a colesterolului plasmatic la șoarecii apoE KO este transportată în particule de dimensiunea VLDL. Profilul lipoproteinelor plasmatice al șoarecilor PDZK1/apoE dKO a fost similar, dar vârful dimensiunii VLDL a fost mai mare (Fig. 2). În condițiile utilizate pentru aceste experimente (diluare substanțială a probelor din cauza nivelurilor ridicate de colesterol total), nu am detectat vârfuri de dimensiunea HDL în niciuna dintre probele de la șoareci PDZK1/apoE dKO, în timp ce ocazional am observat un pic HDL mic în probe apoE KO. Raportul neesterificat la colesterolul total (UC: TC) al fracțiilor FPLC din regiunea VLDL (neprezentat) a indicat că raportul UC: TC a fost mai mare la șoarecii PDZK1/apoE dKO, în concordanță cu rezultatele măsurătorilor plasmatice totale.

Plasma recoltată de la șoareci individuali hrăniți cu o dietă Paigen timp de trei luni a fost fracționată în funcție de dimensiune utilizând FPLC și conținutul total de colesterol al fracțiilor (mg/dl plasmă) a fost determinat prin test enzimatic. Profilele au fost calculate în medie din 2 experimente independente pentru fiecare genotip, fiecare compus din plasmă reunită din șase șoareci apoE KO (cercuri deschise) și șase șoareci PDZK1/apoE dKO (cercuri umplute) per experiment. Sunt indicate pozițiile aproximative de eluare ale VLDL uman, IDL/LDL și HDL.

Hiperlipidemia este un factor de risc pentru ateroscleroză și boli coronariene [1]. Datorită creșterii lipidelor plasmatice în dieta Paigen hrănită cu PDZK1/apoE dKO comparativ cu șoarecii apoE KO, am evaluat apoi ateroscleroza la rădăcinile aortice și arterele coronare ale acestor șoareci. Imaginile reprezentative ale secțiunilor înghețate ale rădăcinilor aortice, în care lipidele neutre au fost colorate cu ulei roșu O (panourile superioare A și B) și cuantificarea acestei colorări ca măsură a aterosclerozei (panoul superior dreapta) sunt prezentate în Figura 3. Ambele PDZK1 Șoarecii/apoE dKO și apoE KO au prezentat cantități semnificative de ateroscleroză. A existat o creștere cu 26% a ariei medii a leziunii la rădăcinile aortice ale șoarecilor PDZK1/apoE dKO comparativ cu cele ale șoarecilor apoE KO (0,825 mm 2 ± 0,057 față de 0,654 mm 2 ± 0,024, 8 animale pe grup, P = 0,015) . Aceste rezultate confirmă studiile noastre anterioare care arată că PDZK1 este ateroprotector la șoarece apoE KO [21]. Colorarea imunohistochimică a secțiunilor cu anticorpi care recunosc macrofagele (CD68) și celulele musculare netede (actina musculară alfa-netedă) au arătat că macrofagele au fost copleșitor cea mai abundentă componentă celulară a leziunilor aterosclerotice atât la șoarecii apoE KO, cât și la șoarecii PDZK1/apoE dKO, în timp ce celulele musculare netede au fost mai puțin abundente (Figura 3, C - F).

Inimile au fost recoltate de la șoareci apoE KO (A, C - D) hrăniți cu diete Paigen și PDZK1/apoE dKO (B, E - F) șoareci așa cum este descris în Metode (n = 8 per genotip). Panourile din stânga sus: A - B: secțiuni transversale reprezentative ale leziunilor rădăcinii aortice colorate cu roșu uleios. (mărire, × 20). Panoul din dreapta sus: cuantificarea aterosclerozei rădăcinii aortice prin planimetrie. Testul t al Studentului nepereche a fost utilizat pentru a determina semnificația statistică. Panouri inferioare: imunohistochimia plăcilor aterosclerotice ale rădăcinii aortice utilizând CD68 (C și E) sau anticorpii actin α-SMA (D și F) ai mușchilor alfa-arătați că macrofagele compun populația copleșitoare de celule din plăcile aterosclerotice ale rădăcinii aortice și că celulele musculare netede sunt rare atât la șoarecii apoE KO (C - D), cât și la șoarecii PDZK1/apoE dKO (E - F). „L” indică lumenul vascular, săgețile indică celule pozitive reprezentative (mărire, × 100).

O caracteristică comună a bolilor cardiace umane este leziunile aterosclerotice coronare coronare ocluzive și fibroza miocardică asociată. Cu toate acestea, există doar câteva modele murine care recapitulează robust aceste fenomene, în special după perioade relativ scurte (Figura 4. Efectele pierderii PDZK1 asupra aterosclerozei coronare și a fibrozei cardiace la șoarecii apoE KO.