scurta descriere

Download NANOTEHNOLOGII ȘI INTERACȚIUNE CU CELULELE.

celulele

Descriere

NANOTEHNOLOGII ȘI INTERACȚIUNE CU CELULELE P. COUVREUR Profesor la Universitatea Paris-Sud Profesor la Collège de France Chaire d’Innovation Technologique 2009-2010

VOIES D’ENTREE DANS LA CELLULE H. Hillaireau și P. Couvreur, CMLS, 2009

Endocitoza mediată de Clathrin

TRAFIC INTRACELLULAIRE H. Hillaireau și P. Couvreur, CMLS, 2009

INTERACȚIA NANOPARTICULELOR CU CELULELE Macrofage

NANOPARTICULELOR POATE ELIBERA ANTIBIOTICE ÎN COMPARTIMENTUL INTRACELULAR ÎN CARE SUNT BACTERII O. Balland și colab., J. Antimicr. Chemother., 1995

INTERACȚIA NANOPARTICULELOR CU CELULELE Celulele endoteliale

TRANSLOCAREA NANOPARTICULELOR PRIN RATEL EXPERIMENTAL BBB Translocarea nanoparticulelor (%)

E. Garcia-Garcia și colab., CMLS, 62, 1400-1408 2005

PEG-PHDCA PHDCA DEGRADAT PEG-PHDCA

30 60 90 120 150 180 210 240 270 Timp (min)

NANOPARTICULELE DE CIANOACRILAT PEGILAT SUNT PRELUCRATE DE RBEC PRIN PITURI ÎNCOPERATE CĂI DE ENDOCITOTIC Kim HR și colab., Cell Mol Life Sci., 64, 356-364 (2007)

Celule martor (a), 10 min pre-tratament cu 3 µg/mL filipină (disolvent calveolae) (b), 3 µg/m nistatină (disruptor calveolae) (c), 50 µM clorpromazină (previne formarea gropilor acoperite) (d) și 0,1% azidă de sodiu (inhibitor al căii mediate de receptor dependente de energie) (e). Bara reprezintă 20 um.

Proteinele implicate în aceste endocitoze mediate de vezicule

… ȘI ESTE IMPLICAT RECEPTORUL LDL Kim HR și colab., Cell Mol Life Sci., 64, 356-364 (2007)

INTERACȚIA NANOPARTICULELOR CU CELULELE Celulele epiteliale

TRAFICUL INTRACELULAR ÎN CELULE EPITELIALE A NANOPARTICULELOR ÎNCĂRCATE NEGATIV ȘI POSITIV Harush-Frenkel O. și colab., Biomacromolecule, 2008

P58 anticorp de șoarece

Acumularea intracelulară de formulări NP. (A) Celule MDCK renale epiteliale polarizate incubate cu NP cationice și anionice (verzi), anticorpi monoclonali incubați de șoarece (roșu). Fluorescențele combinate (galbene) prezintă o suprapunere parțială a NP-urilor și a membranei plasmatice laterale în colorarea galbenă. (B) Celulele MDCK incubate cu NP cationice și anionice verzi) și LysoTracker (roșu). Fluorescența combinată prezintă suprapunerea NP anionice și LysoTracker (galben), dar nu și NP cationice și lysoTracker.

+ NP scapă din lizozomi

- NP s-a încheiat în lizoze

INTERACȚIA NANOPARTICULELOR CU CELULELE Celulele canceroase

PLGA NANOPARTICULE CARE CONȚIN ADN p53 S. Prabha și V. Labhasetwar, Mol Pharmacol, 2004

Celulele cancerului de sân MDA

Date RT-PCR ale celulelor transfectate cu gena wt-p53: Banda 1: Marker de greutate moleculară, Banda 2: p53 NP-uri încărcate cu ADN, Banda 3: p53 (- ve) NP-uri încărcate cu ADN, Banda 4: numai ADN p53; Banda 5: β-actină pentru nanoparticule încărcate cu ADN p53, Banda 6: β-actină pentru nanoparticule încărcate cu ADN p53 (- ve), Banda 7: β-actină pentru ADN p53. C) Activitatea antiproliferativă a ADN-ului wt-p53: celulele MDA-MB-435S au fost tratate fie cu (a): ADN plasmidic wt-p53, fie cu nanoparticule încărcate cu ADN wt-p53 (NP) sau (b): ADN-Lipofectamine ™ complex.

AMELIORAREA PENETRĂRII INTRACELULARE PRIN FUNCȚIONALIZAREA NANOVECTORILOR Funcția de recunoaștere

LEGĂTURA MONOVALENTĂ A UNUI DROG VERSUS LEGAREA POLIVALENTĂ A UNUI NANOCARIER

REZONANȚĂ PLASMONALĂ ȘI LEGARE MULTIVALENTĂ B. Stella și colab., J. Pharm. Ști., 2000 B. Stella și colab., J Drug Target., 15, 146-53 (2007)

VESICULE DE POLIMER FUNCȚIONALIZATE DE POLY G Ben-Haim N și colab., Nano Letters, 8, 1368-1373 (2008)

Copolimer ABA Poli (2-metiloxazolină) -poli (dimetilsiloxan) -b- poli (2metiloxazolină) formând nucleul nano-purtătorului funcționalizat cu acid poliguanilic (PolyG recunoaște receptorii scavenger ai macrofagelor) și umplut cu BSA fluorescent

Incubație cu macrofage THP-1 activate D: vezicule BSA-polyG E: fără BSA F: vezicule BSA

G: Ac LDL Alexa Fluor 488 I: Merge

H: vezicule BSA-polyG

J: Incubație cu embr de șoarece. Fibroblaste K: celule musculare scheletice de șobolan L: celule endoteliale ale ficatului de șobolan

VESICULE POLIMERICE FUNCȚIONALIZATE SUNT COLOCALIZATE CU LIZOZOMI ȘI GOLGI: RETICULUM ENDOPLASMIC DAR NU CU MITOCHONDRIA ȘI NUCLEUL Ben-Haim N și colab., Nano Letters, 8, 1368-1373 (2008)

PolyG-nanovesicule (roșu) + Lysosensor (verde) Merge (galben)

C și G: Colorare nucleară (albastru) D și H: PolyG-nanovesicule (roșu) E: Aparat endoplasmatic Golgi și Reticulum (verde) I: Mitocondrie (verde) F și J: fuzionează

VESICULE DE POLIMER FUNCȚIONALIZATE CARE CONȚIN TRIPPSINĂ SUNT FUNCȚIONALE INTRACELULAR ÎN MACROFAGELE THP-1 Ben-Haim N și colab., Nano Letters, 8, 1368-1373 (2008)

Vezicule polyG de tripsină

Substratul hidrofob BZiPAR este transformat în rodamină fluorescentă verde atunci când tripsina este eliberată din nanoreactor

INTELIGENȚĂ AMELIORAREA PENETRĂRII PENTRU FUNCȚIONALIZAREA NANOVECTORULUI Funcția de penetrare intracelulară

TAT PEPTIDE JS. Wadia și colab., Nature Med, 10, 310-315 (2004)

Proteina TAT-Cre intră în celulă, translocează nucleul, excizează segmentul ADN STOP, înainte de a marca expresia proteinei fluorescente verzi (EGFP)

Sulfatul de condroitină B și C și heparina previn legarea la suprafață a TAT. Astfel, este necesară legarea suprafeței celulare a + TAT-Cre încărcat cu - membrana celulară încărcată

TRANSDUCȚIA MEDIATĂ CU TAT ESTE JS LIPID RAFT DEPENDENT. Wadia și colab., Nature Med, 10, 310-315 (2004)

TAT-Cre se colocalizează în vezicule endosomice cu FM4-64, un marker de vezicule endocitice

Nistatina sau β-ciclodextrina care epuizează sau sechestrează colesterolul, duc la inhibarea dozată a EGFP

TRANSFECȚIA TUMORILOR CEREBRALE PRIN TAT-LIPOZOME V. Torchilin și colab., ADDR 2007

(A) Șoricel injectat fără TATp și (B) șoarece injectat cu complexe ADN-lipozomi modificate TATp așa cum se observă în urma fluorescenței GFP pe secțiunile coronare ale tumorii cerebrale (200 ×)

NANOPARTICULE DE OXID DE FIER DECORATE TAT Lewin M și colab., Nature Biotechnol, 18, 410-414, 2000

Particulele magnetice dezvoltate constau dintr-un miez central de oxid de fier superparamagnetic (galben), protejat steric de dextran reticulat (verde). Miezul particulelor măsoară 5 nm, iar dimensiunea totală a particulelor este de 45 nm. Peptida Tat derivată de FITC (albastră) a fost atașată la dextranul aminat, obținându-se în medie patru peptide per particulă. Suprafața dextran a fost, de asemenea, modificată cu chelatorul DTPA (roșu) pentru marcarea izotopilor.

CAPTURA CELULARĂ A NANOPARTICULELOR DE OXID DE FIER DECORAT DE TAT Lewin M și colab., Nature Biotechnol, 18, 410-414, 2000

(A) celule CD34 + (B) celule progenitoare neuronale de șoarece (C17.2) (C) limfocite CD4 + umane și (D) splenocite de șoarece.

LOCALIZAREA INTRACELULARĂ ȘI REȚINEREA ASUPRAȚIEI CELULARĂ A NANOPARTICULELOR DE OXID DE FIER DECORAT DE TAT Lewin M și colab., Nature Biotechnol, 18, 410-414, 2000

(A) Microscopie confocală a CLIO-Tat (verde) în celula CD34 +, nucleu marcat cu iodură de propidiu (mijloc) și folosind optica Nomarski (dreapta). (B) Analiza citometriei în flux cu două culori a celulelor CD34 + marcate cu CLIO-Tat. Axa y reprezintă intensitatea medie a fluorescenței CLIO-Tat-FITC, în timp ce axa x reprezintă CD34-PE. NEG pe axa y (stanga punctului stâng) se referă la controlul imunoglobulinelor PEconjugate. (C) Diagrama intensității medii a celulelor marcate CLIOTat-FITC (dreapta; curbă umplută) și a celulelor CD34 + nemarcate (stânga, linie continuă). (D) Cinetica retenției CLIO-Tat în celulele CD34 + în timp comparativ cu markerul membranei celulare PKH26.

CONCEPȚIA NANOVECTORILOR INTELIGENTI

LE CONCEPT DU LIGAND DEMASQUE Torchilin V, Adv. Drug Del Rev, 58, 1532-1555 (2006)

LIPOZOMI DECORATI TAT ETICHETATI CU RODAMINA INCUBATI CU CELULE ASTROCITOMALE U-87 V. Torchilin et al., ADDR, 2007

Lipozomii conțin 18% mol PEG non-clivabil cu PEG - PE (PEG previne complet internalizarea lipozomilor mediată de TATp prin protejarea grupurilor TATp).

Lipozomii conțin 18% mol PEG-Hz clivabil cu pH - PE și au fost pre-incubați la pH 5,0 timp de 20 de minute (îndepărtarea stratului PEG permite absorbția eficientă a lipozomilor mediată de TATp de către celule).

MICELLE POLIMERICE MULTIFUNCȚIONALE SENSIBILE LA pH. Lee și colab., Nano Letters, 5, 325-329 (2005)

Acid polilactic-PEG-polistidină Polistidina este responsabilă de destabilizarea micelelor la pH acid (pKb histidină = 6,5)

purtător de medicament sensibil la pH

Biotina este expusă și endocitoza mediată de receptorul biotinei tigger

ÎNREGISTRĂRI PENTRU EXPUNEREA LA BIOTINĂ LA pH 6,5-7

ES. Lee și colab., Nanoletters, 5, 325-329 (2005).

Micelă de test biotină sensibilă la pH + avidină Micelă de control fără biotină

Captarea celulară a biotinei-micelelor de către celulele MCF-7 care exprimă receptorul biotinei la pH diferit. Răspândirea colorantului către nucleu a fost atribuită efectului „burete de protoni”

CITOTOXICITATEA DOXORUBICINEI ÎNCĂRCATE MICELE SENSIBILE LA pH PE CELULE MCF-7 ES. Lee și colab., Nanoletters, 5, 325-329 (2005).

Distribuția doxorubicinei (roșu) încărcată pe micelele FITC (verde). Merge (galben)

Citotoxicitatea micelelor de biotină încărcate cu doxorubicină la pH 7,4 (negru), 7,2 (negru), 7,0 (alb) și 6,8 (alb)

Concurență între micelele de biotină dox și biotină (citotoxicitate la pH 7)

CONCLUZII - Interacțiunea nanovectorilor (nanoparticule, lipozomi, miceli a) cu celulele în funcție de natura vectorului și celula celulei în ajutorul liganzilor cu penetrarea penetrării intracelulare a vectorilor - Nanotehnologiile favorizează permanent penetrarea intracelulară a molecule care nu difuză în interiorul celulei