Fiziologie integrativă

Editat de
Brian J. Morris

Universitatea din Sydney, Australia

Revizuite de
WEI YE

Universitatea Sun Yat-Sen, China

Bună Yang

Universitatea de Știință și Tehnologie Huazhong, China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

obezitatea

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Ortopedie, Spitalul Sir Run Run Shaw, Școala de Medicină, Universitatea Zhejiang, Hangzhou, China
  • 2 Laborator cheie de degenerare și regenerare a sistemului musculo-scheletic Cercetări translaționale din provincia Zhejiang, Hangzhou, China

Introducere

Durerea lombară (LBP) poate fi o tulburare cronică care afectează grav calitatea vieții (Waddell și Burton, 2001; German și Foley, 2005). Prevalența globală a LBP în populație este de 15% ~ 30%, din care mai mult de 40% este atribuită degenerescenței discului intervertebral (IDD) (McBeth și Jones, 2007). Etiologia IDD este complicată, dar pare să implice inflamații, încărcări mecanice excesive, moștenire genetică și o reducere a aportului de nutrienți (Inoue și Espinoza Orias, 2011; Chen și colab., 2013; Weiler, 2013; Gologorsky și Chi, 2014; Peng și Lv, 2015).

Obezitatea este o boală cronică caracterizată prin acumularea excesivă de grăsime corporală (Melo și colab., 2014) cu indicele de masă corporală (IMC) ≥ 28 conform criteriilor de diagnostic chinezești (Zhu și colab., 2017). Poate afecta metabolismul întregului corp și poate duce la o serie de probleme de sănătate, cum ar fi colesterolul ridicat, diabetul, bolile cardiovasculare, artrita și tumorile (Wang și colab., 2006; Yamamoto și colab., 2012). Obezitatea afectează mai mult de 2/3 din persoanele din Statele Unite (Yang și Colditz, 2015).

Creșterea dovezilor clinice arată că obezitatea este strâns legată de dezvoltarea IDD. La pacienții adolescenți, IMC este semnificativ legat de IDD, iar IDD este mai severă la pacienții supraponderali și obezi comparativ cu cei cu greutate normală (Samartzis și colab., 2011). Un studiu de analiză a polimorfismului nucleotidic unic (SNP) al masei grase și genei asociate obezității (gena FTO) a arătat o corelație semnificativă între SNP RS 11076008 loci G/G genotip și IDD în populația Han, ceea ce sugerează că obezitatea poate fi un factor important inducerea IDD (Sheng și colab., 2017). Obezitatea abdominală (măsurată prin circumferința taliei, grosimea abdominală a grăsimii și grosimea subcutanată ventrală) este legată pozitiv de gradul Pfirrmann de degenerare a discului la adulții tineri (Takatalo și colab., 2013) și de o meta-analiză cuprinzătoare de Xu și colab. (2015b) au arătat că obezitatea este unul dintre cei mai mari factori de risc pentru IDD. Obezitatea ar putea iniția IDD prin creșterea încărcării fizice a coloanei lombare (Adams și Roughley, 2006), dar pot fi implicate și influențe metabolice.

Scopurile prezentei investigații sunt (a) să clarifice asocierile dintre hipertrigliceridemie și IDD în cazuri clinice, (b) să analizeze indicii lipidici din sânge care sunt legați de IDD într-un model de obezitate cu un conținut ridicat de grăsimi și (c) să exploreze mecanisme specifice prin care acizii grași grăsimea poate influența supraviețuirea celulelor discului intervertebral și metabolismul in vitro. Acest studiu ar putea aprofunda înțelegerea noastră asupra IDD și ar oferi o nouă bază teoretică pentru prevenirea și tratamentul acesteia.

Materiale și metode

Studiul clinic a fost aprobat de comitetul de revizuire a eticii din spitalul Sir Run Run Shaw. Voluntarii au fost de acord cu studiul nostru semnând formulare de consimțământ informat. Toate procedurile la animale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Zhejiang. Fiecare experiment a fost efectuat de cel puțin trei ori.

Studiu clinic

Am analizat retrospectiv 128 de voluntari (73 de bărbați și 55 de femei) care au primit scanare prin imagistică prin rezonanță magnetică (RMN) între ianuarie 2014 și decembrie 2016. Voluntarii au fost excluși dacă radiologia și istoricul lor medical au relevat o tumoare, deformare vertebrală sau fractură, tuberculoză, fumat, băut, diabet sau alte boli care afectează lipidele din sânge. Au fost colectate date clinice, incluzând: înălțimea, greutatea, indicele de masă corporală (IMC), colesterolul total din sânge (TC), trigliceridele (TG), lipoproteinele cu densitate mare (HDL), lipoproteinele cu densitate mică (LDL), lipoproteinele cu densitate foarte mică (VLDL) și apolipoproteina A (Apo A). Degenerescența discului a fost clasificată din RMN în funcție de clasele Pfirrmann (Urrutia și colab., 2016) de un radiolog cu experiență și de un chirurg ortoped senior, care erau orbi de alte informații. Valoarea medie a clasei pentru L1-L2, L2-L3, L3-L4, L4-L5 și L5-S1 a fost calculată pentru fiecare voluntar, iar voluntarii au fost apoi repartizați în grupul „degenerescență disc” (grad mediu Pfirrmann ≥ 3,5) sau Grupul „fără degenerare”. În cele din urmă, voluntarii au fost sortați în funcție de citirea trigliceridelor într-un grup „cu conținut ridicat de grăsimi” (TG> 1,7 mmol/L) și un grup „cu conținut scăzut de grăsimi”.

Model de obezitate cu șobolan cu dietă bogată în grăsimi

Douăzeci de șobolani Sprague - Dawley de sex masculin (în vârstă de 10 săptămâni, greutate medie 200 g) au fost adăpostiți în centrul de experimentare a animalelor de la Universitatea Zhejiang, grad SPF, cu suficientă hrană și apă. Două săptămâni mai târziu, 10 șobolani au fost separați aleatoriu într-un subgrup care a primit o dietă bogată în grăsimi (D12451, New Brunswick, NJ, Statele Unite). Această hrană conținea 45% din caloriile sale sub formă de grăsime (4,7 kcal/g), care conținea 24 g% grăsime, 41 g% carbohidrați și 24 g% proteine ​​(Yokono și colab., 2014). Restul de 10 șobolani au primit o dietă normală (Harlan Teklad, Madison, WI, Statele Unite, furaje # 7001, 3,0 kcal/g), care conținea doar 4,25% din caloriile sale sub formă de grăsimi. Greutatea corporală și lungimea corpului șobolanilor au fost înregistrate în fiecare săptămână, precum și nivelurile de glucoză din sânge (FBG), insulină de post (FINS), peptidă C, acid gras neesterificat (NEFA) TC, TG. Această dietă bogată în grăsimi poate fi considerată a avea succes dacă greutatea corporală a șobolanului devine cu 20% mai mare decât cea a unui șobolan mediu din dieta normală (Xu și colab., 2015a). După 12 săptămâni, șobolanii au fost eutanasiați și coloana vertebrală a fost disecată pentru a obține mai multe exemplare corp vertebral-disc-corp vertebral. Mai multe specimene de la fiecare șobolan au fost fixate în paraformaldehidă 4% pentru examen histologic și imunohistochimic, iar celelalte au fost congelate în azot lichid pentru extracția ARN-ului.

Imunohistochimie

Eșantioanele din grupul cu dietă bogată în grăsimi și din grupul cu dietă normală pentru histologie au fost fixate cu paraformaldehidă 4% la 4 ° C timp de 24 de ore și decalcificate folosind EDTA timp de 14 zile. Au fost apoi secvențial deshidratate, încorporate în parafină și secționate la 5 μm. Secțiunile au fost deparafinizate cu xilen și rehidratate cu etanol gradat. Activitatea endogenă a peroxidazei a fost blocată cu 3% H2O2 timp de 10 minute. Secțiunile subțiri au fost incubate cu tripsină timp de 20 min și incubate cu 5% albumină serică bovină (BSA) și 1% Tween-20 în PBS timp de 30 min. pentru a bloca antigeni nespecifici. Apoi, secțiunile au fost incubate cu anticorpi împotriva aggrecan, Col-II, MMP13, caspaze 3, 7 și 9 (Abcam, Cambridge, MA, Statele Unite; 1: 200), caspases clivate 3, 7, 9 (Cell Signal Technology; 1: 100), bcl-2 (Abcam; 1: 200) și PBS ca martori negativi peste noapte la 4 ° C. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpi secundari conjugați HRP (Abcam; 1: 5000) și contracolorați cu hematoxilină. În cele din urmă, cinci câmpuri vizuale au fost alese în mod aleatoriu din fiecare secțiune și au fost imaginate la 100 × [folosind software-ul Image J 1.48 (Jiang și colab., 2013)] pentru a cuantifica celulele pozitive pentru caspazele 3, 7 și 9 și bcl- 2. Numărul de celule a fost calculat independent de trei cercetători. Au fost utilizate cel puțin trei secțiuni subțiri din fiecare specimen, iar rezultatele au fost medii.

Colorarea tunelului pentru apoptoză

După deparafinare cu xilen și rehidratate cu etanol gradat, secțiuni subțiri au fost incubate cu proteinază K (15 mg/ml) la 37 ° C timp de 15 min. O soluție de 3% de H2O2 a fost utilizată timp de 5 minute pentru stingerea peroxidazei endogene la temperatura camerei și secțiunile au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Un set de detectare a morții celulare (Roche, Basel și Elveția) a fost aplicat secțiunilor in situ conform protocoalelor producătorului (Cho et al., 2015). În microscopul cu fluorescență, intervalele de lungime de undă de excitație și emisie au fost 450-500 nm și respectiv 515-565 nm (Jiang și colab., 2013). Cinci câmpuri au fost alese aleatoriu din fiecare secțiune (imaginat la 100 ×) pentru a cuantifica celulele Tunel-pozitive și au fost utilizate cel puțin trei secțiuni din fiecare specimen.

Cultura celulară a nucleului pulpos

Extragerea celulelor

IVD-urile au fost recoltate de la coloanele lombare ale șobolanilor masculi Sprague-Dawley de 12 săptămâni, imediat după ce au fost eutanasiați. Țesuturile NP asemănătoare gelului din fiecare grup au fost separate de discuri, spălate cu soluția de sare echilibrată a lui Hank (HANK Gibco, Grand Island, NY, Statele Unite) și tăiate în fragmente mici. Fragmentele au fost digerate cu 0,2% colagenază tip II (Sigma, St. Louis, MO, Statele Unite) timp de 3 ore, filtrate printr-un filtru de celule, iar celulele izolate au fost clătite de două ori cu HANK. Celulele au fost apoi cultivate cu mediu de cultură complet (DMEM/F12, Gibco, Invitrogen, Statele Unite) conținând 10% ser fetal bovin (FBS, Gibco, Invitrogen, Statele Unite) și antibiotice într-un mediu de 5% CO2, 37 ° C. Mediul a fost schimbat la fiecare 2-3 zile (Diascro și colab., 1998; Kong și colab., 2014; Cheng și colab., 2016).

Testul proliferării celulare

Celulele NP izolate au fost plantate în plăci cu 96 de godeuri (1 × 104 celule per godeu) cu mediu de cultură complet timp de 12 ore și apoi cultivate (ca mai sus) cu acid palmitic (Sigma, Aldrich, Statele Unite), solubilizate în 10% Soluție BSA timp de 48 de ore. Au fost utilizate următoarele concentrații de acid palmitic: 0, 50, 100, 150, 200, 400, 800 și 1600 μmol/L. Celulele NP din mediul de cultură au fost suplimentate cu Kit de numărare a celulelor-8 (10 μL/100 μ, Sigma). După incubare timp de 2 ore, densitatea celulară a fost estimată din densitatea optică măsurată la 450 nm (Wei și colab., 2010).

Cuantificarea apoptozei prin citometrie în flux

Apoptoza a fost cuantificată folosind kitul de detectare a apoptozei PE Annexin V (BD Biosciences, San Diego, CA, Statele Unite) în conformitate cu protocoalele recomandate (Tints și colab., 2014). Celulele NP au fost recoltate așa cum s-a descris mai sus, colectate împreună prin centrifugare, spălate cu PBS rece de două ori și apoi resuspendate în 200 μL de 1 × tampon de legare a anexinei la o concentrație de 1 × 106 celule per ml. O probă de 200 μL de soluție a fost tratată cu 5 μL de anexină V-PE și 5 μL de 7-amino-actinomicină (7-AAD) și incubată la întuneric la temperatura camerei timp de 30 min, urmată de adăugarea a 400 μL de tampon de legare. Celulele colorate au fost analizate cu ajutorul unui citometru de flux (EpicsAltra; Beckman Coulter, Fullerton, CA, Statele Unite). Celulele cu colorare pozitivă care leagă anexaina V-PE au fost punctate ca celule apoptotice care au fost numărate și reprezentate ca procent din numărul total de celule (Tints și colab., 2014).

Măsurarea intracelulară a speciilor reactive de oxigen (ROS)

ROS intracelular a fost evaluat prin citometrie în flux. Aceasta detectează oxidarea diacetatului de 2,7-diclorodi-hidrofluoresceină fluorofor intracelular (DCFH-DA) utilizând kitul de testare a oxigenului reactiv conform protocoalelor sale (Oxvold și colab., 2002). Rezultatele sunt reprezentate ca intensitate medie a fluorescenței.

PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras din țesuturile NP sau celulele NP ale fiecărei grupe folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, Statele Unite). 1 μg de ARN total a fost utilizat pentru a sintetiza ADNc (MBI Fermantas, Sankt Leon-Rot, Germania). Pentru amplificarea PCR, 20 ml de volum de reacție au inclus 10 ml de amestec 2 × SYBR Premix Ex Taq (Takara, Shiga, Japonia), 0,2 μmol/L fiecare primer, 2 ml de ADNc diluat dublu și apă distilată sterilă conform protocoalelor producătorului . Genele țintă au inclus Aggrecan, colagen de tip II (Col-II), metaloproteinază-matrice-3 (MMP-3), metaloproteinază-matrice-13 (MMP-13). Exemplele de secvențe utilizate sunt prezentate în tabelul 1. Valorile pragului ciclului (Ct) au fost colectate și normalizate la gena de menaj α-Tubulin. 2 −ΔΔCt a fost calculat pentru a estima nivelurile relative de mARN ale fiecărei gene țintă (Li și colab., 2014b; Miao și Zhang, 2015; Terashima și colab., 2016).

tabelul 1. Secvența acidului nucleic a grundelor PCR înainte (F) și inversă (R) ale genelor specifice.

Western blot

Proteinele au fost izolate folosind tampon de liză RIPA cu inhibitori de protează și inhibitori de fosfatază (Beyotime, Nantong, China). Proteinele au fost separate prin electroforeză pe gel SDS-PAGE și transferate la membranele fluorurii de polivinilen (PVDF). Membranele PVDF au fost tăiate în funcție de diferite greutăți moleculare ale proteinelor și incubate cu anticorpi primari împotriva pro PARP, pro caspază-3, 7, 9, PARP clivat, caspază-3, 7, 9 clivat (Cell Signal Technology, 1: 1.000) și α-Tubulin (Cell Signal Technology, 1: 1.000) și sondat cu anticorpii secundari respectivi. Pentru grupul de detectare a proteinelor MAPK, membranele PVDF au fost incubate cu anticorpi primari împotriva fosfo-p38, p38, fosfo-ERK, ERK (Cell Signal Technology, 1: 1.000) și α-Tubulin (Cell Signal Technology, 1: 1.000) și apoi sondat cu respectivii anticorpi secundari. Bloturile au fost vizualizate folosind reactivi de chemiluminescență îmbunătățiți (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Statele Unite). Analiza densitometriei a fost efectuată cu imaginea J (Bio-Rad, Hercules, CA, Statele Unite). Această evaluare semicantitativă a proteinelor depinde de determinarea nivelurilor de gri, care a fost efectuată în imaginea J 1.48 (Elbaz și colab., 2010; Li și colab., 2014a, b).

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± Deviație standard (STD). Toate procedurile statistice au fost efectuate utilizând software-ul SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, Statele Unite). Fiabilitatea interobserver a fost analizată folosind statistica kappa (Olsen, 1989). Elevi t-testul a fost utilizat pentru a evalua diferențele dintre două medii de grup, iar ANOVA a fost utilizat pentru a compara mediile a trei sau mai multe grupuri. Testul sumei de rang Wilcoxon a fost utilizat pentru date non-normale (așa cum a fost stabilit de un singur eșantion Kolmogorov - Testul Smirnov (Bucova și colab., 2015). Testul Chi-pătrat a fost utilizat pentru a compara proporțiile. Regresia logistică a fost utilizată pentru factori de risc semnificativi pentru degenerarea discului. Diferențele au fost considerate semnificative statistic dacă p 0,05) și nu au existat diferențe semnificative în proporția de sex, înălțime sau greutatea corporală între grupurile „degenerescență disc” și „non-degenerare”. Cu toate acestea, grupul de degenerare a discului a fost puțin mai vechi (P = 0,007) și au avut niveluri mai ridicate de triglicerideP = 0,012) și IMC mai mareP ∗ P ∗∗ P ∗ înseamnă P-valoare ∗∗ înseamnă P-valoare ∗ înseamnă P-valoare ∗∗ înseamnă P-valoare Cuvinte cheie: obezitate, apoptoză, matrice extracelulară, cale MAPK, degenerescenta discului intervertebral

Citație: Zhang X, Chen J, Huang B, Wang J, Shan Z, Liu J, Chen Y, Li S, Fan S și Zhao F (2019) Obezitatea mediază apoptoza și dezechilibrele metabolice ale matricei extracelulare prin activarea căii MAPK în degenerarea discului intervertebral. Față. Fiziol. 10: 1284. doi: 10.3389/fphys.2019.01284

Primit: 31 iulie 2019; Acceptat: 25 septembrie 2019;
Publicat: 10 octombrie 2019.

Brian James Morris, Universitatea din Sydney, Australia

Wei Ye, Universitatea Sun Yat-sen, China
Cao Yang, Universitatea de Știință și Tehnologie Huazhong, China

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare ca și co-autori