Abstract

Analiza calitativă a urinei poate verifica abstinența abuzului de droguri, dar nu poate detecta modificări ale consumului de medicamente. Pentru medicamentele cu eliminare lentă, cum ar fi metamfetamina (MA), un singur episod de abuz poate duce la până la 5 zile de screening pozitiv al medicamentelor în urină. Astfel, intervențiile care produc scăderi substanțiale ale consumului de droguri, dar care nu obțin abstinența aproape completă sunt clasificate ca ineficiente. Folosind doze non-farmacologice de l-metamfetamină marcată cu deuteriu (l-MA-d3) am dezvoltat o metodă simplă și robustă care estimează în mod fiabil modificările aportului de MA. Doisprezece subiecți au fost dozați cu 5 mg de l-MA-d3 zilnic și au fost provocați cu 15, 30 și 45 mg de d-MA neetichetat (d-MA-d0) după ce au atins statutul stabil de plasmă de l-MA-d3. Raporturile de concentrație urinară de d-MA-d0 la l-MA-d3 au asigurat o separare clară a dozelor administrate cu creșteri ale dozei de 15 mg. Dozele administrate nu au putut fi rezolvate folosind numai concentrațiile de d-MA-d0. În concluzie, urinarul [d-MA-d0]: [l-MA-d3] oferă o măsură cantitativă și continuă a expunerii ilicite la MA. Metoda detectează în mod fiabil modificări mici, relevante din punct de vedere clinic, în aportul ilicit de MA de probe de urină aleatorii, este susceptibilă de desfășurare în studiile clinice și poate fi utilizată pentru a cuantifica modelele abuzului de MA.

Introducere

Epidemiile abuzului și dependenței de metamfetamină (MA) au loc în întreaga lume (Schifano și colab., 2007; Degenhardt și colab., 2008; McKetin și colab., 2008), alimentate de sinteza ilicită a 197-624 tone medicamente asemănătoare amfetaminei pe an, suficient pentru mai mult de 10 miliarde de doze MA de 30 mg (http://www.unodc.org/documents/wdr/WDR_2010/World_Drug_Report_2010_lo-res.pdf). Unii dintre acești agresori devin dependenți care creează consecințe sociale, de sănătate și criminalitate care afectează toate nivelurile societății (Watanabe-Galloway și colab., 2009). Astfel, există o nevoie urgentă de a dezvolta tratamente pentru dependența de MA. Din păcate, în ciuda unui efort intens din ultimii 20 de ani, niciun medicament nu s-a dovedit eficient pentru tratamentul dependenței de MA (Karila și colab., 2010).

Rezultatele testelor calitative de toxicologie a urinei sunt principalele măsuri de rezultate obiective pentru majoritatea studiilor antidicție, inclusiv studiile pentru dependența de MA. Imunoanalizele de urină care sunt sensibile (dar nu specifice) și ieftine și care pot fi desfășurate în clinică sunt frecvent utilizate în aceste studii. Pentru a elimina rezultatele fals pozitive, se confirmă identitatea medicamentului și se măsoară concentrația medicamentului în urină utilizând metode de testare sensibile și specifice care includ întotdeauna spectrometria de masă (SM). Deși aceste metode produc concentrații de urină precise și precise, mai mulți factori, inclusiv vârsta, starea de hidratare, pH-ul urinei și fluxul de urină, fac dificilă, dacă nu chiar imposibilă, extrapolarea înapoi de la concentrația de urină la cantitatea de droguri abuzată. În consecință, rezultatele testelor de droguri în urină sunt marcate doar ca o serie temporală de rezultate binare „pozitive” sau „negative”.

Abstinența este scopul tratamentelor pentru dependență, iar toxicologia calitativă a urinei este extrem de sensibilă pentru detectarea consumului de droguri la indivizii de obicei abstinenți. Cu toate acestea, nu este sensibil la detectarea reducerilor sau a perioadelor scurte (până la 2-3 zile) de abstinență la indivizi. Astfel, sunt necesare reduceri extrem de mari ale abuzului (poate până la 90%) înainte ca o reducere modestă a rezultatelor pozitive la analiza urinei să fie evidentă și tratamentul va fi acceptat ca fiind eficient (Institutul Național pentru Abuzul de Droguri/Colegiul pentru Probleme de Dependență de Droguri, 1999). Acest grad de strictețe poate fi motivul eșecului tuturor tratamentelor pentru dependența de MA testate până în prezent. Dacă este puțin probabil ca noile tratamente pentru abuzul de stimulente să producă abstinență totală bruscă, atunci metodele calitative care nu pot măsura mai puțin decât abstinența totală nu sunt susceptibile de a fi utile în selectarea medicamentelor sau a altor candidați la tratament care pot scădea, dar nu elimină aportul ilicit. Luând în considerare lista în creștere a studiilor eșuate pentru dependența MA, dezvoltarea metodelor care permit estimarea continuă nonbinară a aportului de medicamente a devenit esențială.

Pentru a determina aportul ilicit, am testat utilitatea administrării de doze orale mici, inactive farmacologic, de medicamente sau metaboliți etichetați cu deuteriu, care au profiluri farmacocinetice similare cu medicamentul de interes abuzat. Apoi, determinăm rapoartele de concentrație urinară ale medicamentului (sau metaboliților) marcat cu deuteriu neetichetat (ilicit și autoadministrat) pentru a ajunge la o estimare a aportului și a expunerii la droguri dependente. Metoda este analogă cu utilizarea unui standard intern în chimia analitică.

În acest articol prezentăm validarea de laborator a unei metode de estimare cantitativă a expunerii la MA. Atunci când este utilizată într-un studiu clinic, această metodă schimbă o măsură binară într-o măsură continuă și va permite evaluarea eficacității parțiale a unui tratament supus. Pentru a evalua aportul de MA am utilizat l-MA trideuterat cu etichetare deuteriu pe grupul metil. În lucrările anterioare am arătat că acest nivel de deuterare nu modifică farmacologia MA la om (Harris și colab., 2003). l-MA [de asemenea notat R - (-) - MA] este izomerul mai puțin activ farmacologic comparativ cu d-MA [notat și S - (+) - MA]. În lucrările care au condus la acest studiu, am stabilit că dozele orale de 5 mg de l-MA sunt complet absorbite, nu au efecte subiective sau cardiovasculare măsurabile și sunt ușor de detectat în urină (Li și colab., 2010).

Materiale și metode

Subiecte.

Doisprezece subiecți sănătoși, nedependenți, care utilizează MA (opt bărbați, patru femei; vârsta medie 31 ± 10 ani; greutate medie 72 ± 13 kg; 83% alb) au participat la acest studiu. Pentru a fi incluși subiecții trebuie să fi folosit MA timp de cel puțin 1 an cu mai mult de 20 de expuneri pe viață, dar să nu fie dependenți de MA după criteriile din Manualul de diagnosticare și statistic al tulburărilor mintale, ediția a patra. Participanții au avut o stare de sănătate bună, după cum s-a judecat prin examinarea medicală, testele de laborator (inclusiv chimia serică hematologică, hepatică și renală), analiza urinei și ECG. Studiul a fost aprobat de California Pacific Medical Center și de Universitatea din California, comitetele de revizuire instituționale din San Francisco. Studiul a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki.

Design de studiu.

A fost folosit un design cu etichetă deschisă, cu secvență fixă, cu faze secvențiale ambulator-intern. Au fost administrate doze orale de 5 mg de l-MA-d3 timp de 14 zile. În zilele 1 până la 7 subiecți erau ambulatori. În această perioadă, o doză orală unică de 5 mg l-MA-d3 a fost administrată în fiecare dimineață sub supraveghere directă. Subiecții au fost admiși în secția de cercetare în ziua 7. În zilele de studiu 8, 10 și 12, s-au dat o serie de doze ascendente de d-MA-d0 intravenos de 15, 30 și 45 mg. Fiecare doză de d-MA-d0 a fost administrată timp de 1 min sub controlul pompei de perfuzie (Harvard Apparatus Inc., Holliston, MA). Doza de 15 mg a fost administrată sub formă de perfuzie unică. Doza de 30 mg a fost administrată ca două perfuzii de 15 mg cu doze separate de 1 oră. Doza de 45 mg a fost administrată sub forma a cinci perfuzii de 9 mg separate fiecare câte 1 oră. Acest model a fost conceput pentru a simula o binge d-MA.

Înainte de fiecare ambulatoriu, au fost evaluate efectele farmacodinamice ale dozei de l-MA-d3. Subiecții au fost monitorizați timp de 1 oră după administrare și au avut măsuri la scara analogică vizuală și semne vitale măsurate înainte de externare. În timpul fazei de internare, s-au obținut frecvent semne vitale și măsuri de efect subiectiv. În timpul perfuziilor s-au obținut măsuri subiective și cardiovasculare înainte și la 15 minute după fiecare perfuzie și la 0,5, 1, 1,5, 2, 4 8, 24 și 48 de ore după ultima perfuzie.

Colectarea sângelui.

Probele de sânge venos (aproximativ 7 ml) au fost obținute folosind tehnici sterile dintr-un cateter intravenos aflat în interior. În timpul fazei ambulatorii, s-au obținut niveluri plasmatice minime înainte de administrare. În zilele de perfuzie au fost obținute probe de plasmă pentru nivelurile de d-MA-d0 și l-MA-d3 înainte și la 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24 și 48 de ore după administrare. Pentru dozele de 30 și 45 mg, s-au obținut probe de plasmă suplimentare imediat înainte și la 15 minute după fiecare perfuzie și la 0,5, 1, 2, 4, 8, 24 și 48 de ore după ultima doză.

Colectare de urină.

În timpul fazei de internare, subiecții au fost anulați după cum este necesar. Toată urina goală a fost colectată cu timpul, volumul și pH-ul urinei fiecărei probe individuale înregistrate.

Bioanaliză.

D-MA-d0 și l-MA-d3 în plasmă și urină au fost măsurate prin cromatografie gazoasă combinată (GC) -MS, folosind dl-MA-d9 ca standard intern. Analitele au fost extrase din biofluidele respective, convertite în derivați de trifluoroacetil amidă, separați prin cromatografie gazoasă pe o coloană analitică Restek Rtx-200 MS (Restek, Bellefonte, PA) și detectați prin spectrometrie de masă operată în modul de ionizare chimică, utilizând izobutan ca gaz reactiv. Speciile de ioni moleculari (M + H) +, m/z 246, 249 și 255, au fost monitorizate pentru trifluoroacetil amidele MA-d0, MA-d3 și respectiv MA-d9. Precizia între zile pentru măsurarea MA-d0 și MA-d3 în urină a variat de la 108 la 109%, respectiv, la limita de cuantificare de 5 ng/ml și de la 100 și respectiv 105%, la 2500 ng/ml. Coeficienții de variație respectivi au fost de 12 și 7,5% la limita cantitativă și 4,5 și 5,3% la 2500 ng/ml. În toate cazurile, MA-d3 ar putea fi cuantificat cu ușurință pe un fundal de MA-d0.

Analiza farmacocinetică.

Datele farmacocinetice pentru d-MA-d0 și l-MA-d3 au fost analizate utilizând modele neliniare cu efect mixt implementate folosind programul NONMEM (versiunea 7; NONMEM Project Group, Universitatea din California, San Francisco). Un model farmacocinetic populațional (bazat pe date complete de la 12 subiecți) de dozare repetată orală de l-MA-d3 indică faptul că starea de echilibru farmacocinetică a atins în 5 zile de la administrarea orală zilnică de 5 mg de l-MA-d3. Modelul complet va fi prezentat într-un articol separat.

Analiza datelor urinare.

Raportul de concentrație de urină MA nemarcat-marcat, pe care îl notăm formal ca [d-MA-d0]: [l-MA-d3], a fost determinat pentru fiecare probă urinară colectată. Analiza discriminantă liniară a fost utilizată pentru a testa dacă [d-MA-d0]: [l-MA-d3] a diferențiat între dozele administrate de d-MA-d0. Acuratețea clasificatorului a fost evaluată prin validare încrucișată bazată pe subiect. Datele fiecărui subiect au fost clasificate pe baza unui set de instruire format din datele celuilalt subiect. Datorită distribuției sistemice incomplete a MA, eșantioanele de urină colectate în primele 5 ore de dozare d-MA-d0 nu au fost utilizate pentru antrenarea clasificatorului, ci au fost utilizate ca date de testare. O analiză separată a fost efectuată pentru probele de urină colectate la mai mult de 24 de ore după administrare, deoarece raportul concentrației este afectat de administrarea zilnică continuă orală de l-MA-d3 la 24 ore. Testul McNemar a fost folosit pentru a compara acuratețea între metodele de clasificare. A fost utilizat un model de regresie liniară pentru a descrie relația dintre urinar [d-MA-d0]: [l-MA-d3] și doza corespunzătoare de MA. Benzile de predicție de 95% au fost calculate pentru a reflecta incertitudinea cu privire la observațiile viitoare și pentru a indica distribuția în care se așteaptă să cadă 95% din observațiile viitoare (Dalgaard, 2008). Toate calculele au fost efectuate folosind R.

Rezultate

Siguranță și tolerabilitate.

Toate dozele de MA testate au fost bine tolerate și nu au avut loc evenimente adverse grave. Nu au existat efecte farmacodinamice măsurabile după oricare dintre dozele de l-MA-d3; d-MA a produs creșteri preconizate ale ritmului cardiac, ale tensiunii arteriale și ale efectelor subiective.

Raport de concentrație urinară, [d-MA-d0]: [l-MA-d3].

Au fost colectate în total 589 de probe de urină; 331 între 0 și 24 h și 238 între 24 și 48 h după dozele de d-MA-d0. În Fig. 1 arătăm concentrațiile de urină d-MA-d0 reprezentate grafic în funcție de timp. Aici, concentrațiile de urină după cele trei doze de d-MA-d0 (analog cu cantități în creștere de aport ilicit) se suprapun substanțial și nu pot fi separate prin doză. Această constatare este în concordanță cu un studiu anterior efectuat pe dependenți de MA care prezintă pentru tratament în care concentrațiile de urină MA variază de la nedetectabile la 300.000 ng/ml. În ciuda unui interval de concentrație care se întinde pe șase ordine de mărime, concentrațiile de urină MA nu au permis predicția cantității de aport ilicit (Batki și colab., 2000).

droguri

Concentrațiile de d-MA-d0 în urină după 15, 30 și 45 mg de d-MA-d0 de la un subiect individual.

Clasificarea probelor de urină în diferite condiții de dozare pe baza metodei folosind [d-MA-d0]: [l-MA-d3] și timpul de la administrare ca predictori.

Raportul dintre dozele de d-MA-d0 și l-MA-d3 în acest studiu a fost de 3 (15 mg MA-d0: 5 mg MA-d3), 6 (30 mg MA-d0: 5 mg MA- d3) și 9 (45 mg MA-d0: 5 mg MA-d3). Atunci când raporturile de dozare au fost tratate ca variabile continue în loc de variabile categorice, raporturile de dozare au fost raportate liniar cu urinarul [d-MA-d0]: [l-MA-d3] (Fig. 4; raport urinar = - 0,44 + 0,62 × raportul dozei; R 2 = 0,8198).

Relațiile dintre urină [d-MA-d0]: [l-MA-d3] și raportul dozei d-MA-d0/l-MA-d3. Linia din casetă este mediana, zona din casetă conține al doilea și al treilea quartile, iar mustațele includ puncte de date care se încadrează în 1,5 ori intervalul intercuartil. Linia neagră continuă este linia de regresie. Liniile punctate sunt benzi de predicție de 95%.

Discuţie

Prezentăm o metodă simplă și robustă de utilizare a dozelor orale farmacologic inactive de l-MA-d3 pentru a estima cantitatea ilicită de MA consumată. Cu această metodă, estimările utile ale expunerii la MA pot fi făcute din specimene de urină spontan spălate într-o fereastră de timp relativ largă.

Rapoartele proprii despre consumul de droguri sunt utilizate în mod obișnuit pentru a evalua cantitatea de consum ilicit. Aceste măsuri pot fi inexacte, deoarece consumatorii de droguri ilicite consumă adesea medicamente impure, diluate și utilizează metode de dozare cu biodisponibilitate incompletă (orală și nazală) sau în care sunt distruse cantități variabile de droguri (adică piroliza cu droguri afumate). Metoda noastră estimează fracția biodisponibilă a dozei ilicite, cantitatea asociată cu activitatea farmacologică și toxicitatea.

Fereastra de detectare (durata de timp în zile după ultima utilizare a unui medicament) care a prelevat secvențial probe de urină continuă să producă rezultate pozitive ale testelor de droguri poate fi afectată de multe variabile. Factorii farmacologici includ doza, calea de administrare, durata de utilizare (acută sau cronică) și rata de eliminare. Mai mulți factori afectează eliminarea, inclusiv vârsta, funcția organelor, pH-ul urinei, starea de hidratare și polimorfismele enzimelor care metabolizează medicamentele (http://www.ndci.org/sites/default/files/ndci/DCR.VI__2.pdf). De exemplu, acidificarea urinei crește dramatic eliminarea MA. Datorită acumulării de medicamente în compartimentele profunde, ferestrele de detectare mai lungi sunt mai probabile la abuzatorii cronici, grup adesea vizat în studiile clinice. Factorii analitici, cum ar fi sensibilitatea testului (concentrația limită) și specificitatea metodei (medicamentul și/sau metabolitul efectiv care este detectat) pot afecta, de asemenea, fereastra de detectare (Jaffee și colab., 2008). AM etichetate și nemarcate au absorbție, distribuție, metabolism și eliminare identice; astfel metoda noastră controlează majoritatea acestor factori intraindividuali și interindividuali.

În concluzie, administrarea de doze inactive farmacologic de l-MA-d3 pe cale orală urmată de cuantificarea urinei [d-MA-d0]: [l-MA-d3] permite estimarea cantității de abuz de MA dintr-un singur exemplar aleatoriu de urină. Cuantificarea expunerii la medicamente din specimene biologice ușor obținute va fi utilă în dezvoltarea de noi tratamente pentru dependența de MA, înțelegerea tiparelor de abuz și determinarea conformității cu farmacoterapiile în timpul studiilor clinice. Introducerea unei măsuri de rezultate continue poate fi o îmbunătățire substanțială față de măsurile de rezultat binare calitative actuale utilizate pentru a evalua abuzul MA. În cele din urmă, este posibilă dezvoltarea unor metode similare pentru alte droguri dependente.

Această lucrare a fost susținută de Institutul Național de Sănătate Institutul Național de Abuz de Droguri [Granturi P50-DA018179, DA012521, P30-DA12393]; Institutul Național de Sănătate Institutul Național de Alergii și Boli Infecțioase Activități Extramurale [Grant R01-AI50587]; și Institutul Național de Sănătate Institutul Național de Științe Medicale Generale [Grant GM26696].