Abstract

fundal

Metilarea ADN-ului a fost identificată recent ca un mediator între expunerea la foamete in utero și o serie de trăsături metabolice și psihiatrice. Cu toate acestea, analizele la nivelul genomului sunt rare, iar analizele transversale sunt împiedicate de mulți factori potențiali de confuzie. Mai mult, relațiile de cauzalitate sunt greu de identificat din cauza lipsei unor modele experimentale controlate. În studiul actual, am combinat, prin urmare, o evaluare cuprinzătoare a diferențelor de metilare a ADN-ului la nivelul genomului la persoanele expuse la marea foamete chineză in utero cu un studiu in vitro în care am privat fibroblastele de nutriție.

Metode

Am comparat diferențele de metilare a ADN-ului din sânge integral între 25 de indivizi uterini expuși la foamete și 54 de indivizi sănătoși de control utilizând platforma HumanMethylation450. In vitro, am analizat modificările metilării ADN în 10 culturi de fibroblaste care au fost private din punct de vedere nutrițional timp de 72 de ore prin reținerea serului fetal bovin.

Rezultate

Am identificat trei regiuni metilate diferențial (DMR) în patru gene (ENO2, ZNF226, CCDC51, și TMA7) care au fost legate de expunerea la foamete în ambele analize. Analiza căilor cu date atât din probe de foamete chinezești, cât și din fibroblaste a evidențiat sistemul nervos și căile de neurogeneză ca fiind cele mai afectate de lipsa nutrițională.

Concluzii

Combinația de date transversale și experimentale oferă indicații că adaptarea biologică la foamete duce la modificări ale metilării ADN la genele implicate în sistemul nervos central.

fundal

Metilarea ADN-ului este unul dintre mecanismele epigenetice care joacă un rol important în răspunsurile celulare la influențele nocive ale mediului care sunt implicate în etiologia multor boli [1]. Studiile arată că expunerea timpurie a vieții la lipsa nutrițională este asociată cu diferențe stabile de metilare a ADN-ului [2, 3]. Privarea nutrițională, în special în utero și la începutul vieții, are efecte dăunătoare asupra dezvoltării umane și crește semnificativ riscul apariției mai multor boli cronice mai târziu în viață [3,4,5,6].

Un exemplu seminal al impactului expunerii in utero la deprivarea nutrițională este studiul de cohortă asupra descendenților de la mamele care au fost însărcinate în timpul iernii foametei olandeze din timpul celui de-al doilea război mondial, care a fost intens și bine documentat, dar cu durată scurtă [7]. Acest studiu a identificat metilarea diferențiată persistentă a factorului II de creștere asemănător insulinei (IGF2), ca un factor cheie de creștere și dezvoltare umană implicat în răspunsul la foamete in uter [3]. Studiile ulterioare ale acestei cohorte au identificat modificările metilării ADN ca mediatori ai asocierii dintre foametea maternă și bolile metabolice la vârsta adultă [6, 8]. Alte diferențe epigenetice asociate cu expunerea la foamete în uter au fost legate de schizofrenie [9] și diabetul de tip 2 [10].

În timp ce foametea olandeză este foametea cea mai studiată în literatura de specialitate, marea foamete chineză (1959–1961) a fost una dintre cele mai mari foamete înregistrate în întreaga lume și a avut consecințe mai grave, ducând la aproximativ 30 de milioane de decese [11]. Descendenții acelor mame care au suferit foamete au avut o lungime mai scurtă [5], au avut o sănătate a vieții mijlocii mai proastă [12] și au avut o rată mai mare de boli cronice [13, 14]. Studiile au arătat, de asemenea, un risc crescut de două ori de a dezvolta schizofrenie la descendenții concepuți la apogeul foametei [15, 16]. Cu toate acestea, la populația chineză a foametei a fost raportat un singur studiu de metilare a ADN la nivelul întregului genom [17]. Pentru a înțelege în continuare impactul foametei materne asupra modificărilor de metilare a ADN la descendenți, am comparat metilarea ADN-ului la nivelul genomului din sângele integral al participanților chinezi expuși la foamete în primul trimestru cu controalele neexpuse de la aceleași populații.

Deoarece un studiu transversal bazat pe populație este supus unei confuzii reziduale și nu permite examinarea efectului direct al privării nutriționale, am efectuat ulterior un studiu in vitro al fibroblastelor umane înainte și după expunerea la deprivarea nutrițională. Combinând rezultatul unei abordări de metilare la nivelul genomului a ambelor studii, ne propunem să oferim o investigație imparțială a modificărilor de metilare a ADN-ului induse de lipsa nutrițională.

Metode

Mostră de foamete chineză

Eșantionul de foamete chineză face parte din studiul nostru anterior și a fost descris mai detaliat în altă parte [9]. Pe scurt, voluntarii au fost recrutați în provincia nordică Jilin, China. Având în vedere penetrarea aproape completă a foametei în ianuarie 1960 și septembrie 1961, se presupune că cei născuți în acea perioadă vor fi expuși. Au fost incluși un total de 79 de participanți sănătoși, dintre care 25 au fost expuși la foamete în primele 3 luni in utero. Toți participanții au acordat consimțământul scris în scris. Tabelul 1 oferă detaliile complete ale participanților.

Studiul fibroblastului in vitro

Experimentul in vitro cu fibroblaste a fost descris mai detaliat anterior [9]. Pe scurt, fibroblastele au fost obținute prin biopsii cutanate de la cinci participanți sănătoși de origine olandeză, dintre care unul era de sex masculin și patru de sex feminin (vârsta medie = 38,4 ani, sd = 7,0) (vezi Tabelul 1). Toți participanții au acordat consimțământul scris în scris. Fibroblastele au fost placate în două flacoane T25 în mediu minim esențial (MEM) (Gibco®) cu 15% ser fetal bovin (FBS) (Gibco®) și 1% penicilină-streptomicină PenStrep (Gibco®) și într-o atmosferă de 95% atmosferică aer și 5% CO2 la 37 ° C (condiții normale). După atingerea confluenței de 70-80%, supernatantul a fost îndepărtat și celulele au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (Reactivi BioWhittaker®, Lonza). Apoi, unul dintre baloanele T25 de la fiecare donator a fost cultivat în stare fără foamete cu mediu minim esențial (MEM) (Gibco®) susținut cu 15% FBS, în timp ce celelalte baloane T25 au fost cultivate numai în mediu minim esențial (MEM) ca stare de foamete. După 72 de ore, celulele au fost recoltate din fiecare balon și depozitate sub formă de pelete de celule pentru izolarea ADN-ului.

Prelucrarea ADN-ului

ADN-ul din probele de foamete din China a fost extras din sângele integral folosind trusa Gentra Puregene (Qiagen, Valencia, CA, SUA). Peletele de celule de fibroblaste au fost utilizate pentru izolarea ADN conform instrucțiunilor producătorului (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrația și calitatea ADN-ului au fost examinate folosind NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, SUA). Conversia bisulfitului fiecărei probe de ADN a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului din kitul Zymo EZ DNA Methylation ™ (Zymo, Irvine, CA, SUA). Calitatea și cantitatea de ADN monocatenar tratat cu bisulfit au fost examinate folosind NanoDrop.

Analiza la nivelul genomului a metilării ADN-ului

Controlul calității pentru fibroblaste a fost efectuat într-un flux de lucru similar cu cel al probelor de foamete chinezești, dar a fost ajustat la noul beadchip EPIC de metilare. Setul de date a fost pre-procesat în versiunea R 3.3.1 cu pachetul meffil [22] utilizând normalizarea funcțională [23] pentru a reduce diferențele non-biologice dintre sonde. Pentru a ține cont de variabilele tehnice de lot, pre-procesarea a fost efectuată într-un set de date mai mare (n = 80), incluzând probe de ADN din alte studii care au inclus ADN din creier și sânge. Cu toate acestea, normalizarea a fost efectuată numai pentru probele de fibroblasti. Nu au existat nepotriviri între sexul prezis de metilare și sexul real și nici nu au existat probe cu valori anterioare pe canalele metilate și nemetilate. Sondele au fost eliminate dacă nu au reușit controlul calității (o detectare p valoare> 0,01 pentru> 10% din probe (n = 4610) sau un număr de mărgele 10% din probe (n = 68)), au fost nespecifice [20] sau au fost una dintre sondele SNP incluse în matrice în scopuri de control al calității. Toate cele 10 probe de ADN de fibroblaste au supraviețuit controlului calității și 862.160 de sonde au fost lăsate în setul de date pentru analize ulterioare.

Atât pentru eșantionul chinezesc, cât și pentru probele de fibroblast, nivelul (procentul) de metilare este exprimat ca a β valoare, variind de la 0 (citozină nemetilată) la 1 (citozină complet metilată), dar analizele au fost efectuate folosind M valori (log2 din β valori), pentru o mai bună validitate statistică [24]. Pentru a examina suprapunerea dintre rezultatele celor două seturi de date, DMR și analize de cale au fost efectuate pentru 397.985 CpG care erau prezente pe EPIC, precum și pentru matricele de 450 k.

Analiza căii

Am efectuat analiza de îmbogățire a setului de gene (GSEA) pentru CpG-uri semnificative nominale care s-au suprapus peste probele de foamete chineză și fibroblaste. Instrumentul SetRank a fost ales în studiul actual pentru analiza GSEA, deoarece ar putea elimina multe lovituri fals pozitive [25], în special cele orientate spre căile neuronale, deoarece aceste gene sunt mult mai abundente și de dimensiuni mai mari. Ontologia genică (GO), Enciclopedia Kyoto a genelor și genomelor (KEGG), WikiPathways și baza de date a căilor Reactome sunt incluse în instrumentul SetRank.

Analiza permutării

Nivelul de semnificație al DMR-urilor identificate a fost confirmat prin analiza permutării p valorile au fost calculate din toate DMR-urile potențiale cu același număr de CpG pe tot genomul. Din potrivirea efectivului DMR identificat în această distribuție, un empiric p a fost derivată valoarea. A fost stabilită probabilitatea de a găsi numărul de DMR suprapuse pe care le-am prezentat din toate potențialele potriviri. Toate aceste analize s-au bazat pe 10.000 de permutări.

Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate folosind R [26]. Analiza asocierii metilării ADN-ului cu foamete în probele de foamete chineze a fost efectuată utilizând regresia liniară cu metilarea ADN ca dependente și estimări ale foametei, vârstei, sexului și proporției de tip celulară pe baza algoritmului Houseman [21], precum și a primului două componente principale ale strămoșilor bazate pe metilarea ADN ca indicatori [19]. În plus, similar cu anterior, ne-am ajustat pentru efectele fumatului obținând un proxy pentru fumat pe baza nivelurilor de metilare a CpG-urilor care anterior erau asociate cu fumatul [27]. Pentru experimentul cu fibroblaste, modificările de metilare în condițiile de foamete au fost evaluate folosind testul de rang asociat al Wilcoxon. Graficele QQ au fost inspectate pentru a evalua inflația și puterea de eroare de tip I (fișier suplimentar 1). DMRcate (versiunea 1.4.2) a fost utilizat pentru a identifica regiunile metilate diferențial (DMR). Semnificația nominală pentru analiza DMR a fost stabilită la 0,01 [28]. Doar DMR-urile cu aceeași direcție de efect (hiper- sau hipometilare) în ambele probe au fost considerate suprapuse.

Rezultate

Identificarea regiunilor metilate diferențial

Analiza metilării CpG unice nu a identificat diferențe semnificative după ajustare pentru teste multiple din cauza puterii insuficiente. Graficul QQ a indicat că analiza a fost insuficientă pentru a detecta sondele metilate diferențial la nivelul genomului (Fișierul suplimentar 1 prezintă graficele QQ). Fișierul suplimentar 2 oferă informații și statistici de testare ale lociilor asociați nominal (18.871 pentru foametea chineză și 56.375 pentru experimentul cu fibroblaste). Două mii șapte sute șase CpG s-au suprapus între locurile asociate nominal ale ambelor experimente. Probabilitatea de a ajunge semnificativă în ambele analize a fost mai mare pentru CpGs din studiul foametei (chi-pătrat = 843,97, df = 1, p valoare Tabelul 2 Trei DMR asociate în mod constant cu foamete în ambele experimente (probe de foamete din China și probe de fibroblaste)

Analiza căii loci CpG identificate

Figura 1 prezintă căile semnificative care sunt asociate cu toate cele 2706 CpG suprapuse din eșantionul de foamete chinezesc și din experimentele cu fibroblaste. Analiza căii se bazează pe bazele de date ale căilor GO, KEGG, WikiPathways și Reactome. Analiza căilor GO a evidențiat trei căi funcționale moleculare semnificative, printre care legarea moleculelor de adeziune celulară este predominantă. Joncțiunea aderentă este cea mai relevantă în ceea ce privește componentele celulare. În plus, am constatat că starea foametei a influențat o gamă largă de procese biologice, printre care sistemele neuronale sunt cel mai puternic implicate. De exemplu, căile în dezvoltarea sistemului nervos, atât neurogeneza pozitivă cât și cea negativă, și morfogeneza de proiecție a neuronilor sunt foarte implicate. Analiza căii din analiza semnificativă Reactome și WikiPathways a arătat că răspunsul la deteriorarea ADN-ului și semnalizarea de către factorul de creștere a nervilor (NGF) sunt în mare parte implicate de lipsa nutrițională.

modificările

Analiza semnificativă a căilor bazate pe CpG (2706) asociate cu foamete atât în ​​studiul faminei chineze, cât și în cel al fibroblastelor. A Căi semnificative din analiza GO. Căile în roșu reprezintă funcții moleculare, în verde reprezintă componente celulare, iar în albastru reprezintă procese biologice. X-axis afișează jurnalul minus p valoarea asocierii cu valoarea SetRank a setului de gene. b Analiză semnificativă a căilor din Reactome și WikiPathways. Calea reactomului este în mov, iar WikiPathways este în portocaliu. X-axis afișează jurnalul minus p valoarea asocierii cu valoarea SetRank a setului de gene

Discuţie

Acesta este primul studiu care combină analiza metilării ADN la nivel de genom a expunerii la foamete cu un studiu in vitro al privării nutriționale pentru a explora efectul foametei asupra metilării ADN-ului. Rezultatele evidențiază mai mulți promotori de gene care sunt metilate diferențial din cauza privării nutriționale. O analiză ulterioară a căilor a arătat că dezvoltarea și semnalizarea sistemului nervos prin factorul de creștere a nervilor (NGF) sunt sensibile la lipsa nutrițională.

În studiul anterior de metilare la nivelul genomului din iarna olandeză a foamei, 181 de gene au fost identificate prin reprezentarea redusă a secvențierii bisulfitului (RRBS) și alte 6 gene au fost verificate în testul EpiTYPER bazat pe spectrometrie de masă [8]. Mai târziu, într-o cohortă de foamete din Bangladesh, au fost identificate șapte epialelele [4]. Deși DMR-urile din aceste studii anterioare nu se suprapun cu DMR-urile noastre, DMR-urile sunt aproape de gene din aceeași cale. De exemplu, ZNF251 și CCDC57 au fost identificate în cohorta olandeză a foamei, în timp ce în studiul nostru, ZNF226 și CCDC51 se găsesc diferențial metilate. Fundalul genetic diferit al celor trei studii de cohortă de foamete ar putea fi una dintre explicațiile acestor diferențe, deoarece vulnerabilitatea la factorii de mediu ar putea fi inerentă genetic [50]. O altă explicație pentru rezultatele divergente ar putea fi că, deși toate cele trei populații au suferit de foamete, modelul de consum rămas a fost probabil destul de diferit între țări. Diferențele în aportul de nutrienți din dietă ar putea duce în cele din urmă la diferite modele de malnutriție și la rezultate diferite.

Căile legate cel mai frecvent de expunerea la malnutriție se află în sistemul nervos și neurogeneză, în special, reglarea pozitivă a dezvoltării sistemului nervos în analiza căii GO (albastru în Fig. 1) și semnalizarea factorului de creștere a nervului (NGF) în analiza WikiPathways (portocaliu) și Fig. 1). Acest lucru indică relevanța ridicată a adaptărilor epigenetice la foamete pentru creier [51] (chiar dacă studiul actual nu a analizat creierul). Impactul foametei asupra creierului a fost arătat în studiile de rozătoare care au arătat modificări epigenetice mari în hipocampus la descendenții șobolanilor lipsiți de nutriție [52].

Efectuarea analizei de metilare a ADN-ului pe fibroblaste, pe lângă sângele integral, crește diversitatea tipurilor de țesuturi și reduce puternic riscul ca factorii reziduali de confuzie să conducă la rezultate. Fibroblastele oferă un tip diferit de țesut și utilizarea analizei longitudinale în cadrul aceluiași participanți oferă posibilitatea de a relaționa direct modificările metilării ADN-ului cu foametea. DMR-urile de replicare din fibroblaste și sânge oferă, prin urmare, dovezi convingătoare că acestea sunt gene relevante care sunt implicate în răspunsul la malnutriție.

Concluzii

Folosind o abordare imparțială la nivel de genom, studiul actual a examinat asocierea dintre metilarea ADN-ului și lipsa nutrițională severă în două probe unice separat (foametea chineză și fibroblastele in vitro) și conduce la identificarea DMR-urilor care au fost în mod constant hipometilate în ambele probe. Cele trei DMR din cei patru promotori genetici ENO2, ZNF226, CCDC51, și TMA7 și implicarea dezvoltării și semnalizării sistemului nervos de către factorul de creștere a nervilor (NGF) care sunt sugerate de analizele căilor pot oferi noi piste pentru a înțelege căile de la lipsa nutrițională la boală.