Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de membranologie celulară, Institutul de fiziologie Bogomoletz, Kiev, Ucraina

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de membranologie celulară, Institutul de fiziologie Bogomoletz, Kiev, Ucraina

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de membranologie celulară, Institutul de fiziologie Bogomoletz, Kiev, Ucraina

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Centrul cardiovascular, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Ain Shams, Cairo, Egipt

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Centrul cardiovascular, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de Medicină, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Centrul cardiovascular, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Departamentul de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Centrul cardiovascular, Colegiul Medical din Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, Milwaukee, Wisconsin

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: A. Staruschenko, Dept. de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, 8701 Watertown Plank Rd., Milwaukee, WI 53226 (e-mail: [e-mail protejat]).

Abstract

Înțelegerea noastră asupra fiziologiei canalului ionic renal provine aproape exclusiv din studii efectuate pe rozătoare sau sisteme de expresie heteroloage. Datorită limitării accesibilității țesuturilor umane, proprietățile moleculare și celulare ale canalelor ionice exprimate în rinichiul uman nativ sunt în mare parte necunoscute. De asemenea, nu s-a stabilit în ce măsură datele obținute pe modele experimentale sunt aplicabile oamenilor. Unul dintre principalii factori care contribuie la limitarea unei comparații directe a activității canalului membranar la diferite specii este absența unui protocol universal și fiabil pentru izolarea componentelor nefronice pentru urmărirea analizelor ex vivo.

Metoda noastră a fost adaptată de la tehnica vibrodisocierii, care a fost introdusă pentru prima dată de Vorobjev în domeniul neuroștiinței (22) și în zilele noastre a devenit un standard de aur pentru izolarea neuronilor și a celulelor gliale (9-11). Aici, arătăm că aplicarea acestei metode pentru izolarea tubulilor și glomerulilor renali are numeroase avantaje față de metodele existente, cum ar fi simplitatea, reproductibilitatea și aplicabilitatea pentru izolarea segmentelor de nefron bine conservate din diferite specii. De asemenea, în prezentul studiu, am estimat adecvarea diferitelor modificări ale acestei metode pentru studiul caracteristicilor canalelor de membrană în tubulii și glomeruli renali de rozătoare și am explorat proprietățile electrofiziologice ale canalelor de membrană majore K + și Na + exprimate în corticalul uman nativ conducte colectoare (CCD).

Izolarea tubulilor renali.

Toate procedurile experimentale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare stabilite de Institutele Naționale de Sănătate Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Colegiului Medical din Wisconsin. Rinichii umani au fost obținuți de la o companie de prelevare de organe, unde au fost recoltați cu intenția de a fi folosiți pentru transplant, dar nu au fost folosiți și au fost destinați aruncării. Rinichii au fost invariabil perfuzați cu soluție de conservare și depozitați pe gheață.

O diagramă schematică a procedurii de izolare a vibrodisocierii este prezentată în Fig. 1A. Pentru experimentele folosind țesut renal uman, o mică porțiune a zonei corticale renale a fost disecată și spălată extensiv în soluție de conservare Wisconsin cu soluție de incubare oxigenată cu următoarea compoziție (în mM): 119 NaCl, 4,5 KCl, 2 CaCl2, 1,3 MgCl2, 26 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4 și 5 glucoză (pH 7,35). Pentru experimentele de rozătoare, șoarecii C57BL/6 și șobolanii sensibili la sare Dahl de diferite vârste au fost anesteziați cu izofluran și ambii rinichi au fost recoltați. Rinichii umani și de rozătoare au fost tăiați în felii de 0,5 până la 1,0 mm grosime, fie manual, fie cu un microtom vibrant. Ulterior, feliile ar putea fi utilizate imediat pentru următorii pași ai procedurii de izolare sau ar putea fi depozitate într-o cameră de incubare cu fund de plasă din plasă de nailon în soluție de incubare saturată cu carbogen la temperatura camerei timp de până la 6 ore.

FIG. 1.Metoda vibrodisocierii pentru izolarea segmentelor de nefron. A: strategia de bază și pașii principali ai metodei, inclusiv prepararea feliilor de rinichi (A), incubarea feliilor în soluție oxigenantă (b), pretratarea enzimatică a feliilor de rinichi (opțional), transferarea feliei de rinichi într-o cutie Petri și fixarea acesteia pe fundul unei farfurii (c) și izolarea mecanică a segmentelor de nefron cu vârful rotunjit al unei micropipete atașat la generatorul de frecvență (d). Forma vârfului și diametrele utilizate pentru studiul nostru sunt prezentate în medalion micrografie. Rețineți că diametrul exterior al micropipetei a fost de 1,5 mm. e: Imagine reprezentativă în câmp luminos a tubulilor renali, izolați de la un șoarece adult, folosind tehnica vibrodisocierii. B: imagini reprezentative ale unui fragment de nefron de șoarece cu o morfologie complexă izolată folosind vibrodisociere. B, stânga: imunomarcarea celulelor principale ale conductelor colectoare cu acvaporină 2 (AQP2; roșu; top), tubul contort distal cu Na + -Cl - cotransportor (NCC; verde; mijloc), și tubul de conectare (fără AQP2 sau NCC) și nuclee (albastru; fund). B, dreapta: imunomarcare combinată (top) și imaginea cu câmp luminos corespunzătoare (fund).

Imunohistochimie.

Tubii renali proaspăt izolați au fost transferați pe lamele de microscopie acoperite cu polilizină și lăsate să adere timp de 5 minute. Tubulii au fost fixați cu paraformaldehidă 4%, permeabilizați, testați cu anticorpi primari (1: 100, Na + -Cl - cotransportor și acvaporină 2) și anticorpii secundari corespunzători marcați fluoroforului Alexa (1: 500, ThermoFisher, Pittsburgh, PA) ca descris anterior (14). Imaginile au fost capturate pe un microscop confocal Nikon A1R inversat folosind un obiectiv Plan Apo × 40 DIC (diafragmă numerică: 0,95) controlat de software-ul Nikon Elements AR (Nikon, Tokyo, Japonia) și procesate folosind software-ul ImageJ.

Analiza cantitativă RT-PCR.

Tubulii cortexului renal au fost izolați prin vibrodisociere de la șobolani în vârstă de 4 săptămâni. Segmentele de nefron au fost identificate la microscop binocular și separate manual. Tubii proximali se pot distinge prin marginile lor luminale de perie și structurile relativ mari. Secțiunile groase ale tubulelor ascendente ale membrelor sunt mai transparente și au o tranziție distinctă de diametru subțire până la grosime. CCD-urile se pot distinge ușor prin suprafața lor în formă de bulă și ramificarea tubulară. Analiza cantitativă RT-PCR a purității fracțiilor de tubuli de șobolan a fost efectuată folosind markeri specifici. Expresia genelor selectate a fost cuantificată prin RT-PCR cantitativă așa cum s-a descris anterior (7). Valorile ciclului de prag final (Ct) au fost determinate utilizând software-ul implementat QuantStudio 6 Flex și normalizate la gena de menaj β-actină.

Experimente electrofiziologice.

Pentru experimentele electrofiziologice, feliile de rinichi au fost pretratate cu enzime înainte de procedura de vibrodisociere, așa cum este descris mai sus. Înregistrările Patch-clamp au fost efectuate în configurația de tensiune-clemă atașată la celulă utilizând un amplificator Axopatch 200B și un convertor analog-digital Digidata 1440A (Dispozitive moleculare). Toate înregistrările electrofiziologice au fost efectuate folosind PSS ca soluție extracelulară. Activitatea canalelor K + și Cl a fost înregistrată din membrana plasmatică basolaterală a CCD-urilor folosind pipete de patch-uri umplute cu o soluție din următoarea compoziție (în mM): 150 KCl, 2 MgCl2 și 10 HEPES (pH 7,35). Activitatea canalului Na + epitelial (ENaC) a fost înregistrată pe membrana plasmatică apicală a tuburilor CCD despărțiți (17) folosind pipete patch-uri umplute cu o soluție din următoarea compoziție (în mM): 140 LiCl, 2 MgCl2 și 10 HEPES ( pH 7,35). Rezistențele pipetelor de patch-uri au variat de la 8 la 10 MΩ.

Imagistica Ca 2+.

Vibrodisocierea permite eliberarea unei cantități mari de glomeruli decapsulați fără pretratare enzimatică a feliilor de rinichi. Glomerulii au fost ușor de definit sub scopul binocular și colectați manual într-un tub conic de plastic (500 pl) care conține PSS. Pentru a detecta modificările concentrației intracelulare de Ca 2+ în podocite (6), fracțiunile glomerulare decapsulate au fost încărcate cu Fluo-8 (2,5 μg/ml, AAT Bioquest) sau o combinație de roșu fur și fluo-4 (5 μM fiecare, Invitrogen ) Vopsele AM ​​cu incubare pe un agitator rotativ pentru

40 min la temperatura camerei. După aceea, suspensia glomerulară a fost transferată pe lamele de acoperire acoperite cu polilizilină, a fost lăsată să se atașeze timp de 5-10 minute și s-a spălat de două ori cu PSS pentru a îndepărta colorantul rămas. Înregistrările imagistice Ca 2+ au fost efectuate în PSS utilizând sistemul de microscop confocal cu scanare laser Nikon A1-R. Pentru a evalua efectul pretratării enzimatice asupra răspunsului Ca 2+ indus de ATP în podocite, feliile de rinichi de șobolan au fost pretratate timp de 20 de minute cu enzime înainte de procedura de vibrodisociere. Pentru analiza datelor, s-au folosit ImageJ și GraphPad Prizm 8.

analize statistice.

Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SE. Datele au fost testate pentru distribuția normală, iar grupurile au fost comparate folosind un Student t-Test.

Spre deosebire de alte metode utilizate pentru obținerea unei fracțiuni în vrac de tubuli renali, tehnica vibrodisocierii permite izolarea directă a țesutului dintr-un sit predeterminat din rinichi, făcând această metodă utilă pentru Western blot, proteomic și studii genomice. Pentru a evalua adecvarea metodei dezvoltate pentru astfel de studii, tubulii și glomerulii izolați de la șobolani vechi de 1 lună au fost identificați prin morfologie sub stereomicroscop și separați manual pe fracțiuni. Experimentele cantitative RT-PCR folosind markeri specifici ai diferitelor segmente de nefron au arătat că puritatea fracțiilor obținute a fost> 85% (Fig. 2).

FIG. 2.Analiza cantitativă RT-PCR a glomerulilor și a fracțiilor de tubuli renali obținute de la șobolani vechi de 1 lună. Cotransportorul Na + -glucoză 2 (SGLT2) a fost utilizat ca marker al tubulilor învoluți proximați (PCT). Na + -K + -Cl - -cotransporter 2 (NKCC2) a fost utilizat ca marker al membrelor groase ascendente ale buclei Henle (TAL). Aquaporin 2 (AQP2) a fost utilizat ca marker al canalelor colectoare (CD).

Este bine stabilit că pretratarea enzimatică poate afecta proprietățile diferitelor canale de membrană (8). Cu toate acestea, pentru protocoale specifice, cum ar fi clema de fixare pe membrana plasmatică basolaterală a tubulilor nefronici, pretratarea enzimatică este esențială pentru a îndepărta o foaie subțire a matricei extracelulare pentru a permite accesul suficient la membrana celulară. Prin urmare, am examinat fezabilitatea utilizării vibrodisocierii pentru studii electrofiziologice. Experimentele cu patch-clamp ale activității cu un singur canal au fost efectuate pe tubuli CCD izolați de la șoareci adulți și rinichi de șobolan (Fig. 3, A și B). Figura 3A arată curentul K + basolateral înregistrat la diferite potențiale de pipetă. Canalul observat a avut o cinetică rapidă de conducere și o conductanță de

48 pS, tipic pentru heterotetramerii Kir4.1/Kir5.1 exprimate abundent pe membrana basolaterală a CCD-urilor (15, 16, 20, 21). Figura 3A a arătat, de asemenea, un canal membranar basolateral cu o probabilitate ridicată deschisă, conductanța de

11 pS și curentul inversat la 0 mV, care corespunde activității tipice pentru canalele Cl - ClC-K2 din CCD (21, 24). Figura 3B arată un exemplu de activitate ENaC (

9,5 pS) înregistrate pe CCD-uri deschise divizate disecate din rinichiul șobolanului utilizând metoda vibrodisocierii în combinație cu pretratarea enzimatică. În experimentele noastre, probabilitatea deschisă medie a ENaC a fost de 0,41 ± 0,06 (n = 8), care nu a fost semnificativ diferit de datele raportate în CCD izolate mecanic (0,34 ± 0,07, n = 7, P = 0,4) (7).

Metoda vibrodisocierii fie cu sau fără pretratare enzimatică ar putea fi de asemenea utilizată pentru izolarea glomerulilor decapsulați cu podocite bine conservate. Glomerulii proaspăt izolați cu sau fără izolație enzimatică au fost încărcați cu indicatori fluorescenți Ca 2+ și utilizați pentru imagistica confocală a răspunsului Ca 2+ indus de ATP în podocitele de șobolan (Fig.C). Analiza datelor obținute a arătat că incubația feliilor de rinichi timp de 20 de minute în soluție enzimatică înainte de separarea glomerulilor a afectat semnificativ răspunsul Ca 2+ indus de ATP în podocite (P = 0,02), sugerând că tratamentul cu enzime poate afecta semnificativ semnalizarea purinergică și/sau influxul de Ca 2+ în podocite.

În cele din urmă, metoda vibrodisocierii a fost utilizată pentru experimentele de fiziologie a rinichilor umani. Figura 4A arată un exemplu de activitate cu un singur canal înregistrat în modul atașat la celulă de la membrana basolaterală a unui CCD uman la diferite potențiale de membrană. Analiza proprietăților biofizice a arătat că curentul înregistrat a fost mediat de activarea canalelor heteromerice Kir4.1/Kir5.1 cu o conductanță de 54 pS (vezi Fig. 3A pentru a compara cu activitatea canalului rozătoarelor). Figura 4B prezintă activitate curentă cu un singur canal în membrana apicală a celulelor principale ale unui CCD uman divizat. Analiza statistică (3 înregistrări din 3 rinichi umani) a arătat că proprietățile electrofiziologice și conductanța de 8,77 ± 0,34 pS ale curenților observați sunt similare activității ENaC în tubulii izolați de rozătoare sau ENaC umane în sistemele de expresie heterologă (5, 13, 17-19).

Figura 4C arată că metoda vibro-disocierii este potrivită și pentru izolarea glomerulilor umani. Figura 4C, dreapta, prezintă răspunsul mediu tranzitoriu Ca 2+ la ATP în podocitele unui glomerul uman izolat fără pretratament enzimatic și încărcat cu indicatori fluorescenți fluor-4 și roșu fura. Aceste date demonstrează că vibrodisocierea poate fi utilizată pentru a izola glomeruli bine conservați, adecvați pentru studii fiziologice și farmacologice ex vivo pe podocite umane.

În general, metoda vibrodisocierii oferă o abordare nouă și convenabilă pentru izolarea și studierea segmentelor de nefron. Spre deosebire de metodele actuale concepute pentru a izola diferite componente ale rinichiului, abordarea dezvoltată permite obținerea unei cantități mari de glomeruli și tubuli renali în regiunea predeterminată a rinichiului în câteva minute. Utilizarea unei camere de incubație cu schimb de soluții saturate de carbogen permite conservarea feliilor de rinichi viabile în timpul zilei experimentale, ceea ce este, fără îndoială, important pentru utilizarea optimă a animalelor experimentale și a rinichilor umani. În plus, metoda dezvoltată permite configurarea ușoară a băncilor de fracțiuni pure ale diferitelor segmente de nefron în condiții de laborator pentru studii suplimentare de biologie moleculară. Arătăm, de asemenea, că tehnica vibrodisocierii ar putea fi utilizată pentru studii electrofiziologice sau imagistice Ca 2+ pe segmente de nefron izolate din diferite specii, inclusiv oameni, deoarece protocolul dezvoltat poate fi adaptat la țesuturile obținute din transplantul de rinichi și materialul de biopsie.

Folosind această metodă, am putut descrie, pentru prima dată, proprietățile electrofiziologice ale canalelor K + și Na + exprimate în celulele canalelor colectoare umane. Mai mult, am evaluat modificările Ca2+ intracelular ca răspuns la ATP în podocite din glomeruli de rozătoare proaspăt izolați în prezența sau absența tratamentului enzimatic.

Pe scurt, metoda vibrodisocierii reprezintă o modalitate versatilă și robustă de separare a segmentelor de nefron bine conservate de o varietate de specii de animale, care îmbunătățește metodologiile actuale pentru izolarea componentelor renale și oferă o platformă excelentă pentru evaluarea proprietăților lor în in vitro. Credem că această metodologie va fi de neprețuit pentru validarea modelelor animale la nivel molecular și va contribui la reducerea unui decalaj în înțelegerea diversității funcției renale între specii.

Această lucrare a fost susținută de subvențiile Institutului Național al Inimii, Plămânilor și Sângelui R35-HL-135749 (către A. Staruschenko), P01-HL-116264 (către A. Staruschenko) și T32-HL-134643 (către CA Klemens), Bursa Centrului Cardiovascular AO Smith Fellowship (către CA Klemens), un Michael Keelan, Jr., MD, Grantul Fundației pentru Cercetarea Centrului Cardiovascular (către O. Palygin) și Grantul Departamentului Afacerilor Veterane I01 BX004024 (către A. Staruschenko).

Niciun conflict de interese, financiar sau de altă natură, nu este declarat de autor (i).

E.I., O.P. și A.S. cercetare concepută și proiectată; E.I., M.F., R.B., C.A.K., S.K., D.G., V.L. și O.P. efectuat experimente; E.I., M.F., R.B., C.A.K., D.G., V.L. și O.P. date analizate; E.I., A.E.-M., O.P. și A.S. interpretarea rezultatelor experimentelor; E.I., M.F., R.B., C.A.K., S.K., O.P. și A.S. figuri pregătite; E.I. si ca. manuscris redactat; E.I., C.A.K., A.E.-M., O.P. și A.S. manuscris editat și revizuit; E.I., M.F., R.B., C.A.K., S.K., D.G., V.L., A.E.-M., O.P. și A.S. versiunea finală aprobată a manuscrisului.

REFERINȚE

NOTE AUTORULUI

* E. Isaeva și M. Fedoriuk au contribuit în mod egal la această lucrare.

  • Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: A. Staruschenko, Dept. de Fiziologie, Colegiul Medical din Wisconsin, 8701 Watertown Plank Rd., Milwaukee, WI 53226 (e-mail: [email protected] edu).

    • pentru